一步一步教你如何做系統(tǒng)進化樹-

大家好：我在此介紹幾個進化樹分析及其相關(guān)軟件的使用和應(yīng)用范圍。這幾個軟件分別是PHYLIP、PUZZLE、PAUP、TREEVIEW、CLUSTALX和PHYLO-WIN〔LINUX〕。在介紹軟件之前，我先簡要地表達一下有關(guān)進化樹分析的一些方法學(xué)問題。進化樹也稱種系樹，英文名叫“Phyligenetictree〞。關(guān)于一個完整的進化樹分析需要以下幾個步驟：=1\*GB2⑴要對所分析的多序列目標進行排列〔Toalignsequences〕。做ALIGNMENT的軟件很多，最常常使用的有CLUSTALX和CLUSTALW，前者是在WINDOW下的而后者是在DOS下的。=2\*GB2⑵要構(gòu)建一個進化樹〔Toreconstrutphyligenetictree〕。構(gòu)建進化樹的算法主要分為兩類：獨立元素法〔discretecharactermethods〕和距離依靠法〔distancemethods〕。所謂獨立元素法是指進化樹的拓撲形狀是由序列上的每個堿基/氨基酸的狀態(tài)決定的〔例如：一個序列上可能包涵很多的酶切位點，而每個酶切位點的存在與否是由幾個堿基的狀態(tài)決定的，也就是說一個序列堿基的狀態(tài)決定著它的酶切位點狀態(tài)，當多個序列進行進化樹分析時，進化樹的拓撲形狀也就由這些堿基的狀態(tài)決定了〕。而距離依靠法是指進化樹的拓撲形狀由兩兩序列的進化距離決定的。進化樹枝條的長度代表著進化距離。獨立元素法包括最大簡約性法〔MaximumParsimonymethods〕和最大可能性法〔MaximumLikelihoodmethods〕；距離依靠法包括除權(quán)配對法〔UPGMAM〕和鄰位相連法〔Neighbor-joining〕。=3\*GB2⑶對進化樹進行評估。主要采納Bootstraping法。進化樹的構(gòu)建是一個統(tǒng)計學(xué)問題。我們所構(gòu)建出來的進化樹只是對真實的進化關(guān)系的評估或者模擬。如果我們采納了一個適當?shù)姆椒ǎ敲此鶚?gòu)建的進化樹就會接近真實的“進化樹〞。模擬的進化樹需要一種數(shù)學(xué)方法來對其進行評估。不同的算法有不同的適用目標。一般來說，最大簡約性法適用于符合以下條件的多序列：=1\*romani所要比較的序列的堿基差別小，=2\*romanii關(guān)于序列上的每一個堿基有近似相等的變異率，=3\*romaniii沒有過多的顛換/轉(zhuǎn)換的傾向，=4\*romaniv所檢驗的序列的堿基數(shù)目較多〔大于幾千個堿基〕；用最大可能性法分析序列則不需以上的諸多條件，但是此種方法計算極其耗時。如果分析的序列較多，有可能要花上幾天的時間才干計算完畢。UPGMAM〔Unweightedpairgroupmethodwitharithmeticmean〕假設(shè)在進化過程中所有核苷酸/氨基酸都有相同的變異率，也就是存在著一個分子鐘。這種算法得到的進化樹相對來說不是很準確，現(xiàn)在已經(jīng)很少使用。鄰位相連法是一個常常被使用的算法，它構(gòu)建的進化樹相對準確，而且計算快捷。其缺點是序列上的所有位點都被同等對待，而且，所分析的序列的進化距離不能太大。另外，需要特別指出的是關(guān)于一些特定多序列對象來說可能沒有任何一個現(xiàn)存算法非常合適它。最好是我們來發(fā)展一個更好的算法來解決它。但無疑這是非常難的。我想如果有人能建立這樣一個算法的話，那他〔她〕完全可以在Proc.Natl.Acad.Sci.USA.上發(fā)一篇高質(zhì)量的文章。下面介紹幾個軟件的使用。首先是PHYLIP。其是多個軟件的壓縮包，下載后雙擊則自動解壓。當你解壓后就揮發(fā)現(xiàn)PHYLIP的功能極其強大，主要包括五個方面的功能軟件：=1\*romani，DNA和蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)的分析軟件。=2\*romanii，序列數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)變成距離數(shù)據(jù)后，對距離數(shù)據(jù)分析的軟件。=3\*romaniii，對基因頻率和連續(xù)的元素分析的軟件。=4\*romaniv，把序列的每個堿基/氨基酸獨立看待〔堿基/氨基酸只有0和1的狀態(tài)〕時，對序列進行分析的軟件。=5\*romanv，按照DOLLO簡約性算法對序列進行分析的軟件。=6\*romanvi，繪制和修改善化樹的軟件。在此，我主要對前兩種功能軟件進行說明。我們現(xiàn)在有幾個序列如下：Mo3ATGTATTTCGTACATTACTGCCAGCCACCATGAATATTGCACGGTACCATMo5ATGTATTTCGTACATTACTGCCAGCCACCATGAATATTGTACGGTACCATMo6ATGTATTTCGTACATTACTGCCAGCCACCATGAATATTGTACGGTACCATMo7ATGTATTTCGTACATTACTGCCAGCCACCATGAATATTGTACAGTACCATMo8ATGTATTTCGTACATTACTGCCAGCCACCATGAATATTGTACAGTACCATMo9ATGTATCTCGTACATTACTGCCAGCCACCATGAATATTGTACGGTACCATMo12ATGTATTTCGTACATTACTGCCAGCCACCATGAATATTGTACGGTACCATMo13ATGTATCTCGTACATTACTGCCAGCCACCATGAATATTGTACGGTACCAT要對這8個序列進行進化樹分析，按照上面的步驟，首先用CLUSTALX排列序列，輸出格式為*.PHY。用記事本打開如下列圖：圖中的8和50分別表示8個序列和每個序列有50個堿基。然后，打開軟件SEQBOOT，如下列圖：按路徑輸入剛剛生成的*.PHY文件，并在Randomnumberseed(mustbeodd)?的下面輸入一個4N+1的數(shù)字后，屏幕顯示如下：圖中的D、J、R、I、O、1、2代表可選擇的選項，鍵入這些字母，程序的條件就會發(fā)生改變。D選項無須改變。J選項有三種條件可以選擇，分別是Bootstrap、Jackknife和Permute。文章上面提到用Bootstraping法對進化樹進行評估，所謂Bootstraping法就是從整個序列的堿基〔氨基酸〕中任意選取一半，剩下的一半序列隨機補齊組成一個新的序列。這樣，一個序列就可以變成了許多序列。一個多序列組也就可以變成許多個多序列組。依據(jù)某種算法〔最大簡約性法、最大可能性法、除權(quán)配對法或鄰位相連法〕每個多序列組都可以生成一個進化樹。將生成的許多進化樹進行比較，按照多數(shù)規(guī)則〔majority-rule〕我們就會得到一個最“逼真〞的進化樹。Jackknife則是另外一種隨機選取序列的方法。它與Bootstrap法的區(qū)別是不將剩下的一半序列補齊，只生成一個縮短了一半的新序列。Permute是另外一種取樣方法，其目的與Bootstrap和Jackknife法不同，這里不再介紹。R選項讓使用者輸入republicate的數(shù)目。所謂republicate就是用Bootstrap法生成的一個多序列組。依據(jù)多序列中所含的序列的數(shù)目的不同可以選取不同的republicate。當我們設(shè)置好條件后，鍵入Y按回車。得到一個文件outfileOutfile用記事本打開如下：這個文件包括了100個republicate。打開DNAPARS〔最大簡約性法〕或DNAML〔最大可能性法〕軟件。將剛剛生成的outfile文件更名后輸入。如下列圖：選項O是讓使用者設(shè)定一個序列作為outgroup。一般選擇一個親緣關(guān)系與所分析序列組很接近的序列作為outgroup〔本例子不選outgroup〕，outgroup選擇的好壞將直接影響到最后的進化樹的好壞。選項M是輸入剛剛設(shè)置的republicate的數(shù)目。設(shè)置好條件后，鍵入Y按回車。生成兩個文件outfile和treefile。Outfile打開如下列圖：該文件包括了227個進化樹。Treefile可以用TREEVIEW軟件打開同樣包涵了這227個進化樹。打開CONSENSE軟件，將剛剛生成的treefile文件更名后輸入。如下列圖：鍵入Y按回車。生成兩個文件outfile和treefile。Treefile用TREEVIEW打開，如下列圖：Outfile打開如下列圖：我們看出兩個樹是同樣的。但在outfile的樹上的數(shù)字表示該枝條的Bootstrap支持率〔除以100.6〕。到現(xiàn)在，8個序列的進化樹分析〔最大簡約法〕已經(jīng)完成。如果要用鄰位相連法對這8個序列進行分析的話，也首先執(zhí)行SEQBOOT軟件將這8個序列變成100個republicate。然后，打開DNADIST軟件，把SEQBOOT生成的文件輸入，如下列圖：選項D有四種距離模式可以選擇，分別是Kimura2-parameter、Jin/Nei、Maximum-likelihood和Jukes-Cantor。選項T一般鍵入一個15-30之間的數(shù)字。選項M鍵入100。運行后生成文件如下列圖：這個文件包涵了與輸入文件相同的100個republicate，只不過每個republicate是以兩兩序列的進化距離來表示。文件中的每個republicate都省略了第一排的Mo3Mo5Mo6Mo7Mo8Mo9Mo12Mo13。以這個輸出文件為輸入文件，執(zhí)行NEIGHBOR軟件。如下列圖：選項M鍵入100。生成兩個文件outfile和treefile用記事本和TREEVIEW打開后，發(fā)現(xiàn)這兩個文件都含有100個進化樹。再將treefile文件更名后輸入CONSENSE軟件，又得到兩個文件outfile和treefile，這就是最后的結(jié)果。以上是對DNA序列的分析，如果要對蛋白質(zhì)序列進行分析，PROTDIST、PROTPARS等軟件。其他軟件的用法可以參照PHYLIP的documents。下面介紹PUZZLE軟件。它是用最大可能性的方法來構(gòu)建進化樹的一個軟件，并