一測(cè)多評(píng)hplc法測(cè)定丹參注射液中原兒茶醛

一測(cè)多評(píng)hplc法測(cè)定丹參注射液中原兒茶醛

丹參注射液是我國的基本藥物品種。被列入《中華人民共和國衛(wèi)生部藥物標(biāo)準(zhǔn)中藥方劑》第20卷。這是在水提取物和丹參酸乙醇沉積法形成的獨(dú)特中藥注射劑。具有活血化瘀、通脈養(yǎng)心的功能。臨床上主要用于冠心病所致胸悶、心絞痛等癥的治療,近年來也廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病、肝病、腎病、急性肺損傷、胰腺炎等病的治療[1~4]。藥理研究表明,水溶性酚酸類成分是丹參注射液發(fā)揮活血化瘀功效的主要成分。按照傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)的“整體觀”,中藥藥效是藥品中多個(gè)藥效成分的綜合效應(yīng),近年來關(guān)于同時(shí)測(cè)定丹參藥材或制劑中多種水溶性成分含量的報(bào)道雖不鮮見,但基本都是采用外標(biāo)法測(cè)定含量[7~11],現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)也采用高效液相色譜法,以外標(biāo)法測(cè)定4種成分(丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B)的含量。由于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)昂貴而不易獲得,應(yīng)用外標(biāo)法每多測(cè)定1種成分都將使檢驗(yàn)成本大幅提高,從而限制了這些方法在藥品質(zhì)量控制中的應(yīng)用。一測(cè)多評(píng)技術(shù)(quantitativeanalysisofmulti-componentsbysingle-marker,QAMS)是當(dāng)前解決這一矛盾的重要途徑之一。本文結(jié)合2011年國家藥品評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)工作,建立了僅以原兒茶醛(protocatechuicaldehyde)為對(duì)照,同時(shí)測(cè)定丹參注射液中丹參素鈉(sodiumdanshensu)、原兒茶酸(protocatechuicacid)、原兒茶醛(protocatechuicaldehyde)、香草酸(vanillaacid)、阿魏酸(ferulicacid)、迷迭香酸(rosmarinicacid)、丹酚酸B(salvianolicacidB)共7個(gè)水溶性成分的一測(cè)多評(píng)方法,并考察了該方法的適用性和可行性,方法簡便,結(jié)果準(zhǔn)確,可在節(jié)約多成分含量測(cè)定檢驗(yàn)成本的同時(shí)較全面地控制該品種內(nèi)在質(zhì)量。1藥物對(duì)照品及藥品測(cè)定島津LC-20A高效液相色譜儀,島津UV-20A紫外檢測(cè)器,WatersSymmetryC18(4.6mm×250mm,5μm)色譜柱,SartoriusR200D分析天平。乙腈、甲醇(色譜純,山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司),三氟乙酸(分析純,上海中秦化學(xué)試劑有限公司),蒸餾水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)。對(duì)照品丹參素鈉(批號(hào):110855-200809)、原兒茶酸(批號(hào):110809-200604)、原兒茶醛(批號(hào):110800-200506)、阿魏酸(批號(hào):110773-200611)、香草酸(批號(hào):10776-200402)、迷迭香酸(批號(hào):111562-201001)、丹酚酸B(批號(hào):111562-201001),均購自中國食品藥品檢定研究院,供含量測(cè)定用。丹參注射液為2011年度國家藥品評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)樣品,來自5個(gè)生產(chǎn)企業(yè),共18個(gè)批次。2方法和結(jié)果2.1.1混合對(duì)照溶液2.2條件12.3方法學(xué)的檢驗(yàn)2.3.1線性域2.3.2精密度測(cè)試2.3.3重復(fù)試驗(yàn)2.3.4穩(wěn)定性試驗(yàn)2.4參比及色譜結(jié)果重現(xiàn)性分析2.4.1待測(cè)指標(biāo)相對(duì)校正因子計(jì)算式中,As、Cs分別為內(nèi)參物對(duì)照品的峰面積和濃度;Ai、Ci分別為待測(cè)成分對(duì)照品的峰面積和濃度。依次精密量取“2.1.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備液5,10,20μL及混合對(duì)照品溶液1,5,10μL分別進(jìn)樣,測(cè)定各成分色譜峰峰面積。以原兒茶醛為內(nèi)參物,計(jì)算丹參素鈉、原兒茶酸、香草酸、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B相對(duì)于原兒茶醛的f,求得各成分6次測(cè)定所得f的平均值分別為8.959,2.573,2.634,1.165,2.269,4.986;RSD分別為0.25%,0.03%,0.05%,0.20%,0.08%,0.06%。2.4.2一測(cè)多評(píng)法待測(cè)色譜峰的定位一測(cè)多評(píng)法色譜峰一般可采用保留時(shí)間差(各待測(cè)成分與內(nèi)參物保留時(shí)間的差值)或相對(duì)保留值(各待測(cè)成分與內(nèi)參物保留時(shí)間的比值)等參數(shù)結(jié)合色譜圖整體特征,以及每個(gè)峰的紫外吸收特征來準(zhǔn)確定位。本研究測(cè)定了相對(duì)保留值、保留時(shí)間差在不同品牌儀器、不同型號(hào)色譜柱上的重現(xiàn)性。結(jié)果表明,相對(duì)保留值的波動(dòng)較明顯(RSD>5%),不宜作為色譜峰定位依據(jù);保留時(shí)間差的波動(dòng)相對(duì)較小,以保留時(shí)間差定位結(jié)果見表3。2.4.3一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果的比較3討論3.1色度條件的選擇3.2內(nèi)部產(chǎn)品的選擇3.3揮發(fā)油a、c、lods-sp,a在不同實(shí)驗(yàn)室,采用WatersSymmetryC18(4.6mm×250mm,5μm)色譜柱,分別考察了2種不同的高效液相色譜系統(tǒng)(A系統(tǒng):島津LC-20A高效液相色譜儀,UV-20A紫外檢測(cè)器;B系統(tǒng):WatersAlliancee2695高效液相色譜儀,Waters2998二極管陣列檢測(cè)器)對(duì)6個(gè)成分相對(duì)于原兒茶醛的f的影響。結(jié)果丹參素鈉、原兒茶酸、香草酸、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B在A系統(tǒng)上的f分別為8.96,2.57,2.63,1.17,2.27,4.99;在B系統(tǒng)上的相對(duì)校正因子分別為8.94,2.53,2.67,1.21,2.23,4.96。采用2種系統(tǒng)求得各成分相對(duì)校正因子的相對(duì)平均偏差≤5.0%。在同一高效液相色譜儀(島津LC-20A)上,考察不同色譜柱[A柱:WatersSymmetryC18(4.6mm×250mm,5μm);B柱:InertsilODS-SP(4.6mm×250mm,5μm);C柱:CAPCELLPAKC18(4.6mm×250mm,5μm)]對(duì)丹參注射液中6個(gè)水溶性成分f的影響。結(jié)果丹參素鈉、原兒茶酸、香草酸、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B在A柱上的f分別為8.96,2.57,2.63,1.17,2.27,4.99;在B柱上的f分別為8.89,2.48,2.51,1.12,2.34,5.05;在C柱上的f分別為8.92,2.37,2.56,1.15,2.25,5.01。3種色譜柱求得各成分f的RSD≤5.0%。3.4結(jié)論2.1回收率與精密度精密稱取丹參素鈉、原兒茶酸、原兒茶醛、阿魏酸、香草酸、迷迭香酸、丹酚酸B的對(duì)照品適量,加70%甲醇溶液制成每1mL分別含丹參素鈉0.605mg、原兒茶酸0.154mg、原兒茶醛0.116mg、阿魏酸0.512mg、香草酸0.112mg、迷迭香酸1.104mg、丹酚酸B1.071mg的溶液作為混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取上述混合對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0mL,置于10mL棕色量瓶中,加70%甲醇溶液稀釋至刻度,即得混合對(duì)照品溶液。取丹參注射液樣品,用微孔濾膜(0.22μm)濾過,即得采用WatersSymmetryC18(4.6mm×250mm,5μm)色譜柱,以乙腈(A)-0.05%三氟乙酸(B)為流動(dòng)相,梯度洗脫(0~7min,2%A→10%A;7~20min,10%A→23%A;20~35min,23%A→27%A;35~45min,27%A→49%A),流速0.8mL·min-1,檢測(cè)波長288nm,柱溫25℃。在上述色譜條件下,取混合對(duì)照品溶液及供試品溶液各進(jìn)樣5μL,色譜圖見圖1。精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備液5,10,20,50,60μL及混合對(duì)照品溶液1,5,10μL,注入液相色譜儀,以色譜峰峰面積(X)為橫坐標(biāo),進(jìn)樣量(Y,μg)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,各成分回歸方程、線性范圍見表1。精密吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液10μL,按“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,測(cè)得丹參素鈉、原兒茶酸、原兒茶醛、香草酸、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B峰面積的RSD分別為0.14%,0.27%,0.27%,0.25%,0.45%,0.33%,0.23%。結(jié)果表明該方法的精密度較好。取同一樣品(批號(hào)100206)的供試品溶液5μL共6份,按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。測(cè)得丹參素鈉、原兒茶酸、原兒茶醛、香草酸、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B平均含量分別為5.755,0.013,0.498,0.035,0.066,0.281,1.260mg·mL-1;RSD分別為0.54%,2.04%,0.36%,1.25%,1.07%,0.85%,0.74%。結(jié)果表明該方法的重復(fù)性較好。取批號(hào)為100206的樣品制備供試品溶液,按“2.2”項(xiàng)下色譜條件分別在0,4,8,12,18,24h進(jìn)樣5μL進(jìn)行測(cè)定。測(cè)得24h內(nèi)丹參素鈉、原兒茶酸、原兒茶醛、香草酸、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B峰面積的RSD分別為0.74%,0.85%,0.25%,0.32%,1.12%,0.31%,0.74%,表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。精密吸取已知含量的樣品(批號(hào)100206)6份,每份1mL,分別置于5mL棕色量瓶中,精密加入每1mL含有丹參素鈉6.12mg、原兒茶酸0.02mg、原兒茶醛0.61mg、香草酸0.02mg、阿魏酸0.05mg、迷迭香酸0.25mg、丹酚酸B1.05mg的混合對(duì)照品溶液1mL,用蒸餾水稀釋到刻度。按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣5μL進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算回收率,結(jié)果見表2。7個(gè)待測(cè)成分加樣回收率在95%~105%以內(nèi),說明該方法準(zhǔn)確度較好。2.3.5測(cè)定化合物的穩(wěn)定性相對(duì)校正因子(relativecorrectionfactor,f)計(jì)算公式為:丹參注射液樣品按“2.1.2”項(xiàng)下方法處理,采用“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣5μL進(jìn)行測(cè)定,用外標(biāo)法對(duì)7個(gè)待測(cè)成分定量測(cè)定,與一測(cè)多評(píng)法測(cè)定結(jié)果比較,驗(yàn)證一測(cè)多評(píng)法用于丹參注射液中7個(gè)酚酸類成分測(cè)定的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明,本文所建立的一測(cè)多評(píng)法以原兒茶醛為內(nèi)參物,測(cè)定丹參素鈉、原兒茶酸、香草酸、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B的結(jié)果與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果無顯著差異(相對(duì)偏差≤5.22%)。比較結(jié)果見表4與表5。丹參注射液中含有大量的酚酸類化合物,且極性范圍跨度較大,故采用梯度洗脫;化合物均含有若干個(gè)酚羥基,呈弱酸性,故采用酸性緩沖系統(tǒng)。采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)檢測(cè)波長進(jìn)行考察,結(jié)果酚酸類化合物在288nm處均呈現(xiàn)良好的紫外吸收,色譜信息最為豐富,故選用288nm作為檢測(cè)波長。試以丹參素鈉為內(nèi)參物,各成分外標(biāo)法與一測(cè)多評(píng)法定量結(jié)果差異顯著,相對(duì)偏差7.88%~33.45%,因此未選用丹參素鈉為內(nèi)參物。當(dāng)以原兒茶醛為內(nèi)參物時(shí),各