一測(cè)多評(píng)法測(cè)定黃柏中5種生物堿類成分

一測(cè)多評(píng)法測(cè)定黃柏中5種生物堿類成分

黃鼠尾是廣州植物的黃皮樹。它對(duì)加熱和干燥也很有效。它具有清熱除濕、清火除蒸發(fā)、解毒和艾酒療法的作用。其主要成分有小檗堿、黃柏堿、木蘭花堿、巴馬汀、藥根堿等生物堿類,其中含有量最高的為小檗堿［2-4］?，F(xiàn)代藥理研究表明,鹽酸小檗堿具有抗炎,降血壓,降血糖和免疫調(diào)節(jié)等作用,黃柏堿與降壓作用有關(guān),而巴馬汀、藥根堿為抗病原微生物的有效成分［5-6］。2010年版《中國藥典》以小檗堿和黃柏堿的量作為黃柏質(zhì)量控制指標(biāo),尚不能全面反應(yīng)黃柏的質(zhì)量。目前,雖有文獻(xiàn)報(bào)道,采用HPLC法同時(shí)測(cè)定黃柏中多種生物堿的量［7-8］,但需要多種對(duì)照品,限制了實(shí)際工作中的應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)以小檗堿為參照物,得出黃柏堿、木蘭花堿、藥根堿、巴馬汀與小檗堿之間的相對(duì)校正因子(F),同時(shí)測(cè)定了黃柏中木蘭花堿、黃柏堿、藥根堿、巴馬汀、小檗堿的量,建立一測(cè)多評(píng)法(QAMS)［9-17］,從而降低檢測(cè)成本和時(shí)間,提高方法的實(shí)用性。1試劑和儀器Agilent1200高效液相系統(tǒng),ShimadzuLC-20AT高效液相系統(tǒng),FE20梅特勒-托利多pH計(jì),SartoriusBP211D電子分析天平,KQ-300E超聲儀(40kW),乙腈、甲醇為色譜純,水為超純水,其余試劑均為分析純。木蘭花堿(Must-12022901)、鹽酸黃柏堿(Must-12021407)、鹽酸藥根堿(Must-10122001)、鹽酸巴馬汀(Must-11122703)和鹽酸小檗堿(Must-111212110)均購自成都曼斯特生物科技有限公司,純度為98%。黃柏樣品1~3號(hào)購自廣西,4~7號(hào)購自貴陽,8~9號(hào)購自湖北,10號(hào)購自湖南,11~30號(hào)購自四川滎經(jīng)、青城山、都江堰、彭州、瀘州等地藥材市場(chǎng)和不同的飲片公司。經(jīng)本校生藥室教研室盧先明教授鑒定為黃皮樹PhellodendronchinenseSchneid.的干燥樹皮。2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備2.1一測(cè)多評(píng)方法學(xué)考察2.1.1色譜條件PhenomenexLunaC18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm),ThermoC18(4.6mm×250mm,5μm),DiamonsilC18(2)(4.6mm×250mm,5μm)。柱溫30℃,體積流量1mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)280nm,流動(dòng)相A為乙腈-0.05mol/L磷酸二氫鉀(KH2PO4)(45∶55)(每100mL中加入0.4g十二烷基硫酸鈉,調(diào)節(jié)pH至4.8),流動(dòng)相B為乙腈-0.05mol/LKH2PO4(55∶45)(每100mL中加入0.4g十二烷基硫酸鈉,調(diào)節(jié)pH至4.5),梯度洗脫,0~12min(0B),12~18min(0~100%B),18~40min(100%B),40~42min(100%~0B),42~48min(0B)。上述色譜條件下,各組分分離度良好,色譜圖見圖1。2.1.2對(duì)照品溶液的制備取木蘭花堿、鹽酸黃柏堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿5種生物堿,精密稱定10.24、9.8、9.09、10.92、14.42mg,分別置于10mL量瓶中,用甲醇定容至刻度。再稀釋至適當(dāng)質(zhì)量濃度。精密移取稀釋后的5個(gè)對(duì)照品溶液適量配為混合對(duì)照品溶液。將上述溶液保存于4℃冰箱中備用。2.1.3供試品溶液的制備取黃柏藥材粉末(過4號(hào)篩)約0.5g,精密稱定,置于100mL錐形瓶,精密加入鹽酸-甲醇(1∶100)的混合液40mL,稱定質(zhì)量,超聲30min,冷卻后加鹽酸-甲醇(1∶100)的混合液補(bǔ)足失質(zhì)量,過濾,取續(xù)濾液過0.45μm濾膜,5μL進(jìn)樣。2.1.4線性范圍考察精密吸取上述混合對(duì)照品溶液40、20、10、8、6、4、2、1μL,進(jìn)樣分析,每個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)樣3次,取平均值。以進(jìn)樣量對(duì)峰面積積分值進(jìn)行回歸處理,得小檗堿、木蘭花堿、黃柏堿、藥根堿、巴馬汀的標(biāo)準(zhǔn)曲線見表1。2.1.5校正因子計(jì)算以小檗堿為內(nèi)標(biāo),計(jì)算小檗堿對(duì)木蘭花堿、黃柏堿、藥根堿、巴馬汀的校正因子,見表2。2.1.6精密度試驗(yàn)精密吸取混合對(duì)照品溶液5μL于同一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣5次,記錄木蘭花堿、黃柏堿、藥根堿、巴馬汀、小檗堿的峰面積,得出日內(nèi)精密度分別為0.68%、0.74%、1.30%、0.93%和0.81%。表明儀器較為穩(wěn)定。2.1.7穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取同一供試品溶液5μL分別于配制后的0、2、4、8、12、24、48h測(cè)定峰面積,計(jì)算得木蘭花堿、黃柏堿、藥根堿、巴馬汀、小檗堿穩(wěn)定性的RSD分別為0.66%、0.34%、0.38%、0.11%和0.63%。表明供試品在48h內(nèi)穩(wěn)定。2.1.8重復(fù)性試驗(yàn)稱取黃柏藥材粉末(過4號(hào)篩)約0.5g共6份,精密稱定,按“2.1.3”項(xiàng)下制備樣品,測(cè)定,木蘭花堿、黃柏堿、藥根堿、巴馬汀、小檗堿的RSD分別為1.9%、2.5%、1.3%、1.2%和2.2%。表明該方法重復(fù)性好。2.1.9加樣回收率試驗(yàn)精密稱取0.5g湖北產(chǎn)黃柏藥材粉末(小檗堿含有量3.81%)6份,加鹽酸-甲醇(1∶100)的混合液40mL,稱定質(zhì)量,超聲30min,冷卻后加鹽酸-甲醇(1∶100)的混合液補(bǔ)足失質(zhì)量,過濾,取濾液2mL,加1mL鹽酸小檗堿(1.007mg/mL)定容到10mL,再次超聲30min(重現(xiàn)提取過程),0.45μm濾膜過濾,進(jìn)樣,測(cè)定,計(jì)算,得加樣回收率分別為97.1%、98.8%、96.9%、100.9%、99.0%、95.6%、RSD為1.9%。2.2校正因子的重現(xiàn)性考察2.2.1色譜柱及高效液相色譜儀考察取“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液,進(jìn)樣20、10、8、6、4、2μL,按“2.1.5”項(xiàng)下計(jì)算小檗堿對(duì)木蘭花堿、黃柏堿、藥根堿、巴馬汀的校正因子。不同高效液相色譜系統(tǒng)和不同品牌柱子的相對(duì)校正因子見表3。2.2.2待測(cè)組分色譜峰的定位利用5個(gè)成分色譜行為的不同,以小檗堿為基準(zhǔn)峰計(jì)算各個(gè)化合物的相對(duì)保留時(shí)間,即確定其在色譜圖中的位置。結(jié)果見表4。2.3一測(cè)多評(píng)法與標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定結(jié)果的比較按供試品溶液處理方法制備樣品,分別精密吸取供試品溶液各5μL注入高效液相色譜儀測(cè)定。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法和一測(cè)多評(píng)法分別計(jì)算黃柏中木蘭花堿、黃柏堿、藥根堿、巴馬汀、小檗堿的量,結(jié)果見表5。測(cè)定結(jié)果表明,同一樣品中木蘭花堿、黃柏堿、藥根堿、巴馬汀、小檗堿的量差異較大,小檗堿的量最高,部分地區(qū)不含或含少量藥根堿和巴馬汀。同時(shí),不同產(chǎn)地黃柏生物堿量差異比較大,川產(chǎn)黃柏小檗堿和黃柏堿量較其他產(chǎn)區(qū)高,其中以四川滎經(jīng)產(chǎn)黃柏含有量最高。3流動(dòng)相和色譜柱的選擇應(yīng)用,導(dǎo)致各組分定量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線法和一測(cè)多評(píng)法測(cè)定質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)過程中,考察了鹽酸-甲醇(1∶100)、乙酸-甲醇(1∶100)、60%乙醇和甲醇4種不同提取溶劑,采用超聲提取30min,權(quán)衡5種成分提取效率,結(jié)果以鹽酸-甲醇(1∶100)作為溶劑提取較為完全。同時(shí),考察了乙腈-磷酸鹽溶液作為流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行分析,其峰型較差,色譜峰重疊,改為乙腈-磷酸二氫鉀(十二烷基硫酸鈉,磷酸調(diào)節(jié)pH)后,峰型改善,但木蘭花堿和黃柏堿色譜峰重疊,無法得到有效分離。因?yàn)閷⒛咎m花堿與黃柏堿、巴馬汀與小檗堿同時(shí)有效分離需要不同濃度的有機(jī)相和不同pH。因此,考察不同pH不同乙腈濃度的混合流動(dòng)相作為洗脫劑,最后實(shí)驗(yàn)確定以乙腈-0.05mol/LKH2PO4(45∶55)(每100mL中加入0.4g十二烷基硫酸鈉,調(diào)節(jié)pH至4.8)為流動(dòng)相A,乙腈-0.05mol/LKH2PO4(55∶45)(每100mL中加入0.4g十二烷基硫酸鈉,調(diào)節(jié)pH至4.5)為流動(dòng)相B,作為流動(dòng)相,使各成分完全分離,且峰形較好。本實(shí)驗(yàn)考察了不同色譜柱、液相色譜系統(tǒng)對(duì)小檗堿與木蘭花堿、黃柏堿、藥根堿和巴馬汀之間相對(duì)校正因子的影響,驗(yàn)證一測(cè)多評(píng)法在黃柏質(zhì)量控制中的可行性和技術(shù)適應(yīng)性。標(biāo)準(zhǔn)曲線法和一測(cè)多評(píng)法測(cè)定30批黃柏中生物堿的結(jié)果表明,一測(cè)多評(píng)法與標(biāo)準(zhǔn)曲線法得到的數(shù)值之間沒有顯著性差異,說明建立的校正因子具有較好的可信度,一測(cè)多評(píng)法能同時(shí)測(cè)定黃柏中小檗堿、木蘭花堿、黃柏堿、藥根堿和巴馬汀的量。實(shí)驗(yàn)中,通過對(duì)5個(gè)成分的吸收光譜并結(jié)合3D圖進(jìn)行分析,選擇280nm作為檢測(cè)波長(zhǎng),5個(gè)生物堿都有吸收。黃柏堿及木蘭花堿與另3個(gè)生物堿母核結(jié)構(gòu)不同(巴馬汀、藥根堿、小檗堿),UV響應(yīng)值也存在不同,但一測(cè)多評(píng)法利用數(shù)學(xué)上的轉(zhuǎn)換關(guān)系推算校正因子,并不關(guān)乎化學(xué)結(jié)構(gòu)是否異同,故而雖然每個(gè)成分都不能實(shí)現(xiàn)最優(yōu)的波長(zhǎng)檢測(cè),但在一