木霉屬richoderma真菌資源的開發(fā)利用

木霉屬richoderma真菌資源的開發(fā)利用

木霉屬天竺葵屬和甲殼類動(dòng)物。它是在森林、斜坡、耕地、草地和其他潮濕環(huán)境中傳播的。土壤、枯枝落葉的腐爛木材和其他細(xì)菌的殘?bào)w是其生長(zhǎng)基質(zhì)（巴特，1968；rollson，1970；劉培貴等人）。它的生物多樣性是子帶菌的一個(gè)重要群體。該屬的有性階段曾稱為“肉座菌屬”HypocreaEr.,它們的子座肉質(zhì),平展伏生,扁平墊狀或半球形墊狀,顏色多鮮亮,子囊殼完全包埋于子座內(nèi),罕為半裸露,子囊初期含8個(gè)子囊孢子,成熟時(shí)通常一分為二,形成分子囊孢子,子囊孢子為綠色或無(wú)色。1木霉屬viren特性木霉屬包括其有性階段(“肉座菌屬”)是一類重要的自然生物資源,具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。該屬部分種類對(duì)植物病原真菌具有較強(qiáng)的殺傷能力,因而作為生物防治制劑廣泛使用;其中一些能夠產(chǎn)生纖維素酶、半纖維素酶、木質(zhì)素酶和果膠酶等酶類而倍受關(guān)注,目前比較廣泛地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、工業(yè)、環(huán)境保護(hù)等相關(guān)領(lǐng)域。木霉屬真菌能夠產(chǎn)生多種次級(jí)代謝產(chǎn)物,自1932年Weindling發(fā)現(xiàn)膠霉毒素(gliotoxin)至今,從中分離到的代謝產(chǎn)物已超過(guò)180余種,主要包括:聚酮類(polyketides)、萜烯類(terpenes)、氨基酸及其衍生物等,其生物活性主要表現(xiàn)在:抗植物病原真菌活性、促進(jìn)植物生長(zhǎng)活性、抗酵母活性、抗細(xì)菌活性、抗病毒活性等,廣泛應(yīng)用于植物病害防治,并在生物及其醫(yī)藥領(lǐng)域有一定的應(yīng)用價(jià)值(Inbaretal.1994;Yedidiaetal.2001;Degenkolbetal.2008;Mukherjeeetal.2012)。在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域,國(guó)際上已有50余種木霉生防制劑或菌肥產(chǎn)品注冊(cè)登記,并進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn),利用哈茨木霉TrichodermaharzianumRifai和綠木霉T.virens(J.H.Mill.,Giddens&A.A.Foster)Arx生產(chǎn)的商業(yè)制劑TRICHODEXXTM和Soil‐GardTM被廣泛用于各種植物真菌病害的防治,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用(Ricard1981;Harman1990;Harman&Lo1996)。哈茨木霉可抑制多種植物病原真菌,如引起玉米、大豆、黃瓜猝倒病的絲核菌屬RhizoctoniaDC.(Lifshitzetal.1985;Dutta&Das1999;Mishraetal.2000;Huangetal.2011),引起灰霉病的灰葡萄孢BotrytiscinereaPers.(Kovachetal.2000;Hjeljordetal.2001;Chengetal.2012),引起枯萎病的齊整小菌核SclerotiumrolfsiiSacc.(El‐Katatnyetal.2000;Mishraetal.2000),以及侵染植物根部的草莓絲核菌RhizoctoniafragariaeS.S.Husain&W.E.McKeen(LaMondia&Cowles2002)等。然而,少數(shù)木霉能夠引起蘑菇等真菌的病害,給食用菌栽培帶來(lái)困難,曾使美國(guó)、英國(guó)、加拿大以及韓國(guó)的食用菌產(chǎn)業(yè)遭受上百萬(wàn)美元的經(jīng)濟(jì)損失(Samuelsetal.2002;Parketal.2006;Komon‐Zelazowskaetal.2007)。在工業(yè)上,木霉屬真菌能夠產(chǎn)生多種酶類,其中纖維素酶(cellulases)、葡聚糖酶(glucanases)、果膠酶(pectinases)和木聚糖酶(xylanases)可用于紡織業(yè)的纖維處理、去污劑的生產(chǎn)以及動(dòng)物飼料加工等(Reese&Mandels1989;Nserekoetal.2002)。在環(huán)境保護(hù)方面,木霉屬真菌可用于污水、淤泥的生物降解或轉(zhuǎn)化,使其轉(zhuǎn)變成為混合肥料供人們利用(Mollaetal.2002)。此外,個(gè)別種類還能有效治理由五氯苯酚、硫丹等殺蟲劑引起的土壤污染(Katayama&Matsumura1993;Rigot&Matsumura2002)。木霉屬的應(yīng)用比較廣泛,具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。在理論研究方面,由于該類群的物種多樣性豐富,成為探討真菌系統(tǒng)演化規(guī)律的重要研究材料。因此,不斷挖掘木霉屬的新自然資源兼具理論意義和應(yīng)用前景。2資源和分類研究2.1肉座菌屬分類的研究根據(jù)第十版DictionaryoftheFungi(Kirketal.2008),木霉屬成立于1794年,隸屬于子囊菌門Ascomycota,糞殼菌綱Sordariomycetes,肉座菌目Hypocreales,肉座菌科Hypocreaceae。該屬最初包含4個(gè)種,至今只有綠色木霉TrichodermaviridePers.一個(gè)種仍保留在該屬,其余種均被轉(zhuǎn)移至其他屬。Tulasne&Tulasne(1860)首次揭示了綠色木霉與紅棕肉座菌Hypocrearufa(Pers.)Fr.之間的關(guān)系,即紅棕肉座菌的子囊孢子萌發(fā)后形成其無(wú)性階段——綠色木霉,兩者系同一種真菌生活史中的不同階段,這一觀點(diǎn)直至20世紀(jì)初才被人們所接受。1871年,Harz試圖界定木霉屬,強(qiáng)調(diào)微觀特征,尤其是分生孢子梗分枝特征的分類學(xué)重要性。Oudemans&Koning(1902)首次從土壤中分離得到木霉,并命名為康氏木霉T.koningiiOud.。結(jié)合前人的研究成果,Bisby(1939)研究了大量木霉菌株,提出了廣義的木霉屬概念,指出木霉屬真菌的變異性,認(rèn)為這些形態(tài)各異的木霉菌株都屬于同一個(gè)種,即綠色木霉,其他種名應(yīng)視為同物異名;此觀點(diǎn)曾被不少真菌學(xué)家接受。在木霉屬建立后的近一個(gè)半世紀(jì)中,分類研究并沒有引起足夠重視,主要是它們?nèi)狈Ψ€(wěn)定的形態(tài)特征,至使其分類工作進(jìn)展緩慢。20世紀(jì)30年代初期,Weindling(1932,1934)發(fā)現(xiàn),在培養(yǎng)條件下木素木霉Trichodermalig‐norumTodeexHarz.可以寄生多種土傳病害的病原菌,在土壤中增加其數(shù)量能夠防治某些植物病害的發(fā)生,從而引起了人們的高度重視。20世紀(jì)50年代,研究者又發(fā)現(xiàn)木霉具有非凡的纖維素分解能力,這一發(fā)現(xiàn)加深了對(duì)木霉菌分類學(xué)重要性的認(rèn)識(shí)(Sternberg&Dorval1979),使該屬的分類研究步入快速發(fā)展階段。Rifai(1969)提出第一個(gè)木霉屬的分類系統(tǒng),根據(jù)產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、孢子梗的分枝及孢子特征將木霉菌劃分為9個(gè)集合種(speciesaggre‐gate),該分類系統(tǒng)被普遍采納。Domschetal.(1980)在Rifai分類系統(tǒng)的基礎(chǔ)上,增加了李氏木霉TrichodermareeseiE.G.Simmons和豐孢木霉T.saturnisporumHammill,提供了該屬11個(gè)種的分種檢索表。Bissett(1984)認(rèn)為Rifai的物種概念較寬,需要在形態(tài)學(xué)上進(jìn)一步細(xì)化,綜合了Doi以及其他學(xué)者在肉座菌屬分類方面的觀點(diǎn),將木霉屬分為5個(gè)組(section),即木霉組(sect.Trichoderma)、長(zhǎng)枝木霉組(sect.Longibachiatum)、粗梗組(sect.Pachybasium)、肉座組(sect.Hypocreanum)及土孢木霉組(sect.Saturnisporum),并根據(jù)形態(tài)特征,將已描述的物種納入不同的組,同時(shí)指定了各個(gè)組的模式種,表明它們的有性階段均屬于肉座菌屬,但未建立生活史中無(wú)性階段與有性階段之間一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系。20世紀(jì)90年代末,Gams&Bissett(1998)對(duì)Bissett分類系統(tǒng)進(jìn)行了修訂,將木霉屬土孢木霉組并入長(zhǎng)枝木霉組,將Bissett的5個(gè)組處理為4個(gè)組,包含34個(gè)種,并對(duì)它們的有性階段進(jìn)行了闡述。雖然確立了有性階段‐無(wú)性階段關(guān)聯(lián)的種類僅限于TrichodermacitrinovirideBissett[有性階段:Hypocreaschweinitzii(Fr.)Sacc.]、T.reesei(有性階段:H.jecorinaBerk.&Broome)和T.polysporum(Link)Rifai(有性階段:H.pachybasioidesYoshim.Doi)等少數(shù)種,但為深入探討該類群的分類和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系開辟了新思路和途徑。近年來(lái),在多基因系統(tǒng)發(fā)育分析基礎(chǔ)上,Kullnig‐Gradingeretal.(2002)進(jìn)一步研究了木霉屬種間關(guān)系,認(rèn)為肉座組和粗梗組難以區(qū)分,將前者并入后者,木霉屬僅包括3個(gè)組。隨后,分類研究進(jìn)展加速,新物種不斷發(fā)現(xiàn)。Bissettetal.(2003)描述了亞洲分布的7個(gè)種。Luetal.(2004)對(duì)粗梗組具有無(wú)色子囊孢子的6個(gè)種進(jìn)行詳細(xì)描述,序列分析的結(jié)果表明,TrichodermacroceumBissett和T.polysporumRifai的模式菌株聚類在一起,并在形態(tài)上不易區(qū)分,將前者處理為后者的同物異名。Chaverri&Samuels(2003)系統(tǒng)地研究了具有綠色子囊孢子的40個(gè)種,認(rèn)為其中33個(gè)種為木霉屬真菌;在形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)上,結(jié)合多基因系統(tǒng)發(fā)育分析,新命名了木霉屬和肉座菌屬20個(gè)種。Samuelsetal.(2012a)對(duì)T.stromaticum復(fù)合種進(jìn)行清理,描述了7個(gè)種。Samuelsetal.(2012b)對(duì)長(zhǎng)枝組進(jìn)行了系統(tǒng)的研究,新描述了8個(gè)種,至此,該組包含21個(gè)種。Jaklitschetal.(2013)對(duì)T.viridescens(A.S.Horne&H.S.Will.)Jaklitsch&Samuels復(fù)合種進(jìn)行了整理,描述了11個(gè)種。2.2hypocrea-saccrace.日本腦膠質(zhì)屬hs如前所述,原稱為“肉座菌屬”的真菌是木霉屬的有性階段,該屬以Hypocrearufa為模式種建立(Fries1825),是肉座菌科Hypocreaceae的模式屬。其主要特征為:子座顏色鮮艷,肉質(zhì),內(nèi)部淺色;子囊殼埋生;子囊中8個(gè)具一個(gè)分隔的孢子在發(fā)育早期斷裂為16個(gè)子囊孢子;子囊孢子無(wú)色、綠色至褐色,圓形、橢圓、楔形至矩形,表面具小刺,少有光滑。依據(jù)子實(shí)體形態(tài),子囊孔口及子囊孢子的形態(tài),Saccardo(1883)提出了6個(gè)亞屬的分類系統(tǒng)。Theissen(1911)依據(jù)子實(shí)體形態(tài)和質(zhì)地以及子囊殼的特征,建立了6個(gè)組。Petrak(1940)報(bào)道了2個(gè)種,即HypocreamoravicaPetr.和H.subalpinaPetr.。Dingley(1952,1956,1957)在對(duì)新西蘭肉座菌目真菌進(jìn)行研究時(shí),對(duì)8個(gè)種有性階段的解剖結(jié)構(gòu)進(jìn)行了描述,并在培養(yǎng)中獲得了它們的無(wú)性階段,盡管Dingley發(fā)現(xiàn)無(wú)性階段中存在差異,但仍視為同一個(gè)種,即綠色木霉。隨后,Webster和Rifai(Webster1964;Rifai&Webster1966a,b;Webster&Rifai1968)對(duì)該屬部分種進(jìn)行了修訂,描述了H.piluliferaJ.Webster&Rifai和H.psychrophilaE.Müll.,Aebi&J.Webster。根據(jù)子囊殼著生方式、子座表層細(xì)胞的類型以及無(wú)性階段等特征,Doi(1969,1972)提出了木霉屬2亞屬2組4亞組的分類系統(tǒng),將有性階段與無(wú)性階段的特征相結(jié)合進(jìn)行綜合研究,描述了50余種(Doi1966,1968,1969,1971,1972,1973a,1973b,1975,1976,1978,2001,2006;Doi&Doi1980;Doi&Yamatoya1989;Doietal.2001)。Samuelsetal.(1998)在對(duì)Hypocreaschweinitzii復(fù)合種進(jìn)行處理時(shí),認(rèn)為當(dāng)有性階段特征不足以區(qū)分相似種時(shí),無(wú)性階段特征和分子數(shù)據(jù)成為重要的分種依據(jù)。Chaverri等學(xué)者(Chaverrietal.2001a,2001b,2003;Chaverri&Samuels2002,2003)詳細(xì)描述了40個(gè)具有綠色子囊孢子的種;在屬的概念上,通過(guò)多基因序列分析,將ChromocreaSeaver和CreopusLink處理為肉座菌屬的同物異名。根據(jù)模式種的無(wú)性階段特征和序列分析的結(jié)果,Chamberlainetal.(2004)進(jìn)一步將PodostromaP.Karst.和Podocrea(Sacc.)Lindau也處理為肉座菌屬的異名。Jaklitschetal.(2008a)的研究結(jié)果支持了Chamberlain的觀點(diǎn),即以子座柱狀作為分屬的依據(jù)不合理。Jaklitschetal.(2005,2006a,2006b,2008b)和Jaklitsch(2009,2011)系統(tǒng)地描述了分布在歐洲的75個(gè)種,提供每個(gè)種的詳細(xì)描述以及該屬的分種檢索表。Jaklitschetal.(2012)及Jaklitsch&Voglmayr(2012)又在歐洲發(fā)現(xiàn)了5個(gè)種。我國(guó)對(duì)肉座菌屬的早期記載可追隨到19世紀(jì)90年代,Patouillard(1895)以四川康定的標(biāo)本為模式發(fā)表了Hypocreacornu‐damaePat.,系我國(guó)該類群的首次報(bào)道。其后,Sawada(1919)在臺(tái)灣省報(bào)道了H.lenta(Tode)Berk,由于模式標(biāo)本丟失,無(wú)從查證,Jaklitsch(2011)將其處理為可疑名稱。我國(guó)真菌學(xué)先驅(qū)鄧叔群先生先后報(bào)道過(guò)肉座菌屬10個(gè)種(Teng1934,1935,1936;鄧叔群1963)。此后對(duì)該類群的研究間斷,于上世紀(jì)80年代重啟,日本學(xué)者Doietal.(1984)報(bào)道了來(lái)自臺(tái)灣省的1個(gè)變種H.rufavar.formosanaYoshim.Doi(Doietal.1984);劉培貴等學(xué)者(Liu&Doi1995;劉培貴等2000;Liuetal.2002,2003)對(duì)我國(guó)西南地區(qū)(云南、貴州等)的肉座菌屬真菌進(jìn)行了比較系統(tǒng)的研究,發(fā)現(xiàn)了2個(gè)新種H.fomitopsisP.G.Liu&Yoshim.Doi和H.tropicosinensisP.G.Liu,報(bào)道了5個(gè)中國(guó)新記錄種;又以吉林長(zhǎng)白山的材料為模式發(fā)表了H.corrugataYoshim.Doi,P.G.Liu&M.Tamura(Doietal.2001);Samuelsetal.(1998)以云南西雙版納的材料為模式發(fā)表了H.orientalisSamuels&Petrini.。近年來(lái),中國(guó)已知木霉屬真菌的數(shù)量迅速增長(zhǎng)。以我國(guó)材料為模式發(fā)表了中國(guó)木霉TrichodermasinensisBissett,Kubicek&Szakacs(Bissettetal.2003)、臺(tái)灣木霉T.taiwanenseSamuels&M.L.Wu(Samuelsetal.2006)、紅豆杉木霉T.taxiC.L.Zhang,F.C.Lin&C.P.Ku‐bicek(Zhangetal.2007)、致密木霉T.com‐pactumZ.F.Yu&K.Q.Zhang、云南木霉T.yun‐nanenseZ.F.Yu&K.Q.Zhang(Yuetal.2007)、貴州木霉T.guizhouenseQ.R.Li,E.H.CMckenzie&YongWangbis(Lietal.2013)和新中國(guó)木霉T.neosinenseSamuels&Jaklitsch(Jaklitschetal.2013)。最近,朱兆香和莊文穎(Zhu&Zhuang2014a,b,c;朱兆香和莊文穎2014)按照現(xiàn)代分類學(xué)觀點(diǎn),對(duì)我國(guó)木霉屬有性階段及相關(guān)材料進(jìn)行全面清理,發(fā)現(xiàn)10個(gè)新種(扁平木霉T.applanatumZ.X.Zhu&W.Y.Zhuang、寡孢木霉T.oligosporumZ.X.Zhu&W.Y.Zhuang、蓮座木霉T.rosulatumZ.X.Zhu&W.Y.Zhuang、褐紅木霉T.rufobrunneumZ.X.Zhu&W.Y.Zhuang、南方木霉T.sino‐australeZ.X.Zhu&W.Y.Zhuang、中國(guó)黃木霉T.sinoluteumZ.X.Zhu&W.Y.Zhuang、柄座木霉T.stipitatumZ.X.Zhu&W.Y.Zhuang、天堂寨木霉T.tiantangzhaienseZ.X.Zhu&W.Y.Zhuang、綠黃木霉T.viridi‐flavumZ.X.Zhu&W.Y.Zhuang和余氏木霉T.yuiZ.X.Zhu&W.Y.Zhuang),充分展示了我國(guó)該類群豐富的物種多樣性。迄今為止,我國(guó)已知木霉屬真菌91種(表1)。3肉座菌屬系統(tǒng)發(fā)育研究20世紀(jì)90年代末,Samules等學(xué)者將DNA序列分析引入木霉屬/肉座菌屬的研究(Samuelsetal.1998;Doddetal.2002,2003)。對(duì)肉座菌目系統(tǒng)發(fā)育研究最初是基于18SrDNA序列分析,結(jié)果建立了生赤殼屬BionectriaSpeg.,表明生赤殼屬、叢赤殼屬Nectria(Fr.)Fr.、麥角菌屬ClavicepsTul.和肉座菌屬分別形成了單系群(Spatafora&Blackwell1993;Rehner&Samuels1994,1995)。通過(guò)rDNAITS基因序列分析,Kuhlsetal.(1996)指出,Trichodermareesei的有性階段為Hypocreajecorina;Lieckfeldt&Seifert(2000)強(qiáng)調(diào)了該片段序列分析在肉座菌目分類中的重要性。Lieckfeldtetal.(1998a)對(duì)肉座菌目的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述,尤其關(guān)注肉座菌屬和木霉屬的系統(tǒng)發(fā)育研究。Lieckfeldtetal.(1998b)和Doddetal.(2000)深入探討了肉座菌屬的種間關(guān)系。其他相關(guān)工作還包括:Kuhlsetal.(1997)和Kindermannetal.(1998)對(duì)長(zhǎng)枝組和粗梗組的研究;Samuelsetal.(1998)處理了H.schweinitzii復(fù)合種,并對(duì)有性階段‐無(wú)性階段的關(guān)聯(lián)進(jìn)行探討,發(fā)現(xiàn)H.pseudokoningiiSamuels&Petrini對(duì)應(yīng)T.pseudokoningiiRifai、H.schweinitzii對(duì)應(yīng)T.citrinoviride、H.jecorina對(duì)應(yīng)T.reesei;Samuelsetal.(2000)報(bào)道了T.stromaticumSamuels&Pardo‐Schulth,并闡明它與哈茨木霉和綠木霉的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系;Lieckfeldtetal.(2001)對(duì)H.aureoviridisPlowr.&Cooke/T.aureovirideRifai進(jìn)行了分類和系統(tǒng)發(fā)育分析。隨著木霉屬系統(tǒng)發(fā)育研究的深入,參與分析的基因片段逐步增加,新的成果不斷涌現(xiàn)。基于內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因(ECH42)序列分析,Lieckfeldtetal.(2000)研究了木霉組中各個(gè)種之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系;基于ITS和延長(zhǎng)因子(EF‐1α)基因序列分析,Doddetal.(2002)確定了形態(tài)相似種HypocreapatellaCooke&Peck和H.neorufaPat.的系統(tǒng)發(fā)育位置;通過(guò)28SrDNA、ITS、18SrDNA、EF‐1α和ECH42多基因序列分析,Kullnig‐Gradingeretal.(2002)探討了肉座菌屬的種間系統(tǒng)演化;Jaklitschetal.(2013)首次將基因acl1(largersubunitofATPcitratelyase)用于木霉屬研究,理清了Trichodermaviridescens復(fù)合種的問題。采用RPB2和EF‐1α基因序列相結(jié)合的方法,Jaklitsch(2009,2011)對(duì)木霉屬進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育研究表明,具有綠色子囊孢子和無(wú)色子囊孢子的種分別形成2個(gè)獨(dú)立分支,從而表明子囊孢子的顏色攜帶系統(tǒng)發(fā)育信息;最近,Zhu&Zhuang(2014a,b)采用相似的方法,進(jìn)一步探討木霉屬的種間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,結(jié)果表明產(chǎn)生綠色子囊孢子的成員聚類在一起,形成10個(gè)分支,即Ceramica、Chlorospora、Harzianum、Phyllostachydis、Semiorbis、Spinulosa、Strictipilosa、Stipitatum、Virescentiflava和Virens分支;產(chǎn)生無(wú)色子囊孢子的種聚類在一起,形成9個(gè)主要分支,即Brevicompactum、Hypocreanum、Longibrachiatum、Lutea、Polysporum、Psychrophila、Semiorbis、Stromaticum和Viride。4微生物物種的命名過(guò)去真菌命名遵循《國(guó)際植物命名法規(guī)》(McNeilletal.2006),即維也納法規(guī),該法規(guī)允許子囊菌和擔(dān)子菌的無(wú)性階段擁有獨(dú)立的名稱,并制定了第59條規(guī)則(Article59)來(lái)規(guī)范復(fù)型真菌的命名。目前真菌命名遵循《國(guó)際藻類、真菌及植物命名法規(guī)》