中藥活性成分篩選的通量研究技術(shù)

中藥活性成分篩選的通量研究技術(shù)

目前，中國的創(chuàng)新藥物研究水平仍然很低。臨床藥物長期依賴制備和進(jìn)口，每年進(jìn)口300億元。目前國際上對新藥研發(fā)競爭激烈,但同時(shí)新藥研發(fā)困難重重,研發(fā)速度并未加快,技術(shù)難度不斷提高,2010年僅有20個(gè)新化學(xué)結(jié)構(gòu)藥物獲FDA批準(zhǔn)上市,新藥發(fā)現(xiàn)模式亟待改變。如何使我國擺脫藥物依賴進(jìn)口和仿制的困境是我國醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域的一個(gè)戰(zhàn)略課題。研究表明具有數(shù)千年臨床經(jīng)驗(yàn)的中藥是創(chuàng)新藥物的寶庫,如何從這一寶貴資源出發(fā),在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和高通量技術(shù)支持下推動(dòng)中藥的現(xiàn)代化和國際化是一個(gè)亟待解決的重大問題,具有重大社會(huì)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。中藥現(xiàn)代化和物質(zhì)基礎(chǔ)研究是醫(yī)藥界的研究難題,復(fù)方和藥材含有眾多的活性成分,常規(guī)提取分離和活性篩選不僅速度慢、成本高,而且還存在活性成分易丟失,純度與活性背離的難題。以上問題的解決關(guān)鍵在于三個(gè)方面,一是如何快速得到含有活性化合物的民族醫(yī)藥樣品,二是如何高效研究其中活性成分,排除與主治無關(guān)或毒性成分,三是在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)指導(dǎo)下研究各組分對多靶點(diǎn)的活性。1民族藥分離的應(yīng)用進(jìn)展高通量技術(shù)是解決中藥活性成分研究難題的思路之一。所謂高通量技術(shù)包括高通量制備、高通量篩選、高通量基因芯片、高通量蛋白芯片等技術(shù)?，F(xiàn)代制備色譜技術(shù)以快速、高效、高載樣量和自動(dòng)化為特點(diǎn),融合了傳統(tǒng)色譜的經(jīng)典理論和現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)中的眾多創(chuàng)新之處,解決了許多傳統(tǒng)色譜未能解決的問題?？捎糜谏贁?shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)藥樣品的快速制備和分離?？捎糜诟咄恐苽涞纳V包括快速制備色譜(閃式柱色譜)、中壓制備色譜、高壓制備色譜、高速逆流色譜、超臨界流體色譜等。值得注意的是,提取過程應(yīng)在傳統(tǒng)醫(yī)藥的配伍理論、炮制工藝和使用方法的指導(dǎo)下進(jìn)行,盡量保持所制備組分中的物質(zhì)忠實(shí)于民族藥物的原始面貌,除最常使用的水、乙醇等溶劑提取法,還可采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油、采用壓榨法提取新鮮藥材中含量較高的成分,以及近年發(fā)展起來的超臨界流體萃取法、超聲提取法、微波提取法等都可視具體情況加以應(yīng)用,使藥物中的各種成分得到盡可能全面的提取。研究者常遇到的難題是:在樣品分離過程中,有毒溶劑的使用與殘留是否將對下一步的篩選工作產(chǎn)生干擾,如何保證民族藥物在分離過程中不發(fā)生變性,尤其是微量、不穩(wěn)定、易揮發(fā)成分在分離中得以保留,這些關(guān)鍵技術(shù)問題需要在預(yù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行耐心考察。閃式柱色譜(flashchromatography,FC)屬于中低壓液相色譜的一種,于20世紀(jì)70年代末開始應(yīng)用于天然產(chǎn)物的分離純化。在國外,快速硅膠柱色譜已成功應(yīng)用于天然產(chǎn)物樣品庫的建立,并將樣品庫用于活性物質(zhì)的高通量篩選。近年來,閃式柱色譜技術(shù)引入我國,但在實(shí)驗(yàn)室中的應(yīng)用僅限于植物單體分離和一至幾個(gè)目標(biāo)化合物的純化。由于其快速、便捷、制備量大、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn),應(yīng)用于快速劃段分離,較之常壓與高壓液相色譜應(yīng)具有自身的獨(dú)特優(yōu)勢,因此,本實(shí)驗(yàn)室嘗試將其應(yīng)用于少數(shù)民族藥大復(fù)方全組分的快速劃段分離,在國內(nèi)外均具有創(chuàng)新性,分離結(jié)果見圖1。色譜條件:VenusilMPC18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm);流動(dòng)相甲醇-水體系,甲醇中含0.5%乙酸,線性梯度條件0~35min,5%~70%B;35~40min,70%~100%B;流速1mL·min-1;檢測波長280nm;柱溫30℃;進(jìn)樣量5μL;成分鑒定結(jié)果見圖2。通過閃式柱色譜技術(shù),可以快速分離到數(shù)百個(gè)組分,每個(gè)組分包含一個(gè)單體或?yàn)槎鄠€(gè)單體的組合物,各組分的平均質(zhì)量為200mg,量少者亦在10mg以上,達(dá)到細(xì)胞水平篩選和化學(xué)分析的用量要求,且該方法重復(fù)性高,該技術(shù)用于傳統(tǒng)復(fù)方藥物組分制備屬于國內(nèi)外首創(chuàng),對于中藥研究具有重要應(yīng)用價(jià)值。2中藥提升抗腦卒中作用的藥物靶點(diǎn)AndrewLHopkins在2008年提出“網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是創(chuàng)新藥物研發(fā)的下一個(gè)范式”。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)、系統(tǒng)藥理學(xué)的發(fā)展,與我國中藥的有效成分組/群、多層次多機(jī)制多靶點(diǎn)概念契合度較高,對中藥的發(fā)展具有指導(dǎo)意義。以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為指導(dǎo),研究疾病發(fā)生發(fā)展的基因組和蛋白質(zhì)組,揭示疾病的病理病機(jī),并以此為指導(dǎo),提高開發(fā)創(chuàng)新藥物的科學(xué)性和準(zhǔn)確性。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)認(rèn)為生命是一個(gè)復(fù)雜的過程和體系,疾病是由多個(gè)彼此之間存在著相互作用和動(dòng)態(tài)變化的基因、蛋白引起的基本生理和病理現(xiàn)象?！敖M合藥靶”是中藥藥靶的發(fā)現(xiàn)策略之一。即根據(jù)以往研究進(jìn)展,從基因功能網(wǎng)絡(luò)中尋找中藥治療疾病特異相關(guān)的基因組合,并觀察驗(yàn)證中藥對這些特異性基因組合的影響,提供中藥的生物活性信息。一旦確證中藥影響這些特異性分子組合就可以將這些基因以及由這些基因表達(dá)的蛋白作為該中藥的“組合藥靶”。通過研究驗(yàn)證并完善組合藥靶策略有助于民族創(chuàng)新藥物的出現(xiàn)和中藥的現(xiàn)代化,且由于中藥的活性可以為網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)提供實(shí)證,有助于豐富和發(fā)展網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)。以腦卒中神經(jīng)病變?yōu)槔?國內(nèi)外針對單靶點(diǎn)開發(fā)了大批藥物,但臨床表現(xiàn)均不佳。目前美國FDA只批準(zhǔn)了一個(gè)也是唯一的治療急性缺血性腦卒中的藥物———組織纖溶酶原激活劑。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)理論,基于多靶點(diǎn)的治療策略優(yōu)于傳統(tǒng)的單靶點(diǎn)保護(hù)思路。神經(jīng)-血管單元由神經(jīng)元、血腦屏障、小膠質(zhì)細(xì)胞以及維持腦組織完整性的細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成,各組分間相互聯(lián)系并相互影響,是一個(gè)三維微環(huán)境,可能成為治療腦梗后神經(jīng)病變的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)靶點(diǎn)。神經(jīng)血管單元(neurovascularunit,NVU)概念突破了以往單靶點(diǎn)藥物治療腦梗死神經(jīng)病變的不足,為整體研究腦梗死及保護(hù)機(jī)制、尋找創(chuàng)新藥物提供了新思路。神經(jīng)血管單元中神經(jīng)元的壞死與膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、足細(xì)胞及細(xì)胞基質(zhì)有關(guān),也與缺血、再灌、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞因子途徑有關(guān),腦中風(fēng)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡的信號通路的關(guān)系,可見多機(jī)制、多靶點(diǎn)治療策略的合理性,與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的理論相似,見圖3。通過以上分析,本實(shí)驗(yàn)室認(rèn)為在抗腦卒中神經(jīng)病變藥物研究中可以針對以下靶點(diǎn)或潛在靶點(diǎn):細(xì)胞內(nèi)Ca2+,線粒體膜細(xì)胞色素C,F0F1復(fù)合體,線粒體膜輔酶Q等電子傳遞鏈節(jié)點(diǎn),線粒體基因組,胞漿MMPs,PKC,細(xì)胞因子,自由基,谷氨酸受體等。根據(jù)以上研究進(jìn)展,理性選擇網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)靶點(diǎn)是中藥現(xiàn)代化的有效思路之一,本實(shí)驗(yàn)室針對多個(gè)靶點(diǎn)建立了大復(fù)方白脈散全組分的篩選模型,通過高通量篩選,取得了很好的進(jìn)展。3生物活性篩選技術(shù)的應(yīng)用高通量篩選技術(shù)是指以分子水平和細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)方法為基礎(chǔ),以微板形式作為實(shí)驗(yàn)工具載體,以自動(dòng)化操作系統(tǒng)執(zhí)行試驗(yàn)過程,以靈敏快速的檢測儀器采集實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù),以計(jì)算機(jī)對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理,同一時(shí)間對數(shù)以千萬樣品檢測,并以相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫支持整體系運(yùn)轉(zhuǎn)的技術(shù)體系。民族藥物的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究不能簡單采取高通量藥物篩選模式,但可以借鑒高通量的思路,建立準(zhǔn)高通量的研究方法。即首先根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)理論合理選擇多個(gè)靶點(diǎn),然后構(gòu)建細(xì)胞、分子水平的模型,最后快速評價(jià)各組分的活性,旨在提供網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)所需信息。本實(shí)驗(yàn)針對自由基清除建立高通量篩選模型,對復(fù)方白脈散全組分進(jìn)行篩選和活性評價(jià),得到很好的結(jié)果,見圖4。以上思路中,細(xì)胞水平的活性篩選對于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究極其重要,所采用的技術(shù)包括:細(xì)胞水平重組技術(shù)、熒光檢測分析技術(shù)、極化熒光技術(shù)、時(shí)間分辨熒光能量傳遞分析法、熒光共振能量轉(zhuǎn)移、高內(nèi)涵篩選、活細(xì)胞熒光檢測鈣流的技術(shù)等。細(xì)胞水平篩選方法具有可視化、動(dòng)態(tài)、自動(dòng)化、定量、多參數(shù)檢測等突出特點(diǎn),是目前網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)不可或缺的手段,對于靶點(diǎn)的確認(rèn)、化合物初篩和復(fù)篩、先導(dǎo)的發(fā)現(xiàn)和優(yōu)化、靶標(biāo)化合物毒性評價(jià)等非常有效。其中高內(nèi)涵篩選方法的出現(xiàn),對網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的發(fā)展和應(yīng)用發(fā)揮了關(guān)鍵作用。特別是多細(xì)胞靶點(diǎn)和多細(xì)胞類型的HCS是網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究的關(guān)鍵技術(shù)之一,可能將大大促進(jìn)新藥的發(fā)現(xiàn)。4生物芯片技術(shù)中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中,多靶點(diǎn)多機(jī)制是研究難點(diǎn),有必要借助生物芯片進(jìn)行高通量研究。生物芯片是一類快速、高效、高通量的生物分析器件或集成化分析系統(tǒng),包括微陣列芯片、微流控芯片、芯片實(shí)驗(yàn)室以及相關(guān)的儀器和設(shè)備。它將計(jì)算機(jī)、微電子、微機(jī)械、生物化學(xué)、分子生物學(xué)和生物信息學(xué)等技術(shù)融合到一起,在一個(gè)微小的芯片表面或芯片內(nèi)部的微流體系統(tǒng)研究生物大分子之間或者生物大分子與其他化學(xué)小分子之間的反應(yīng)。生物芯片能整合樣品制備、分子識別和反應(yīng)、信號檢測和信號放大等獨(dú)立的分析過程,使之連續(xù)化、平行化、集成化和微型化。根據(jù)芯片上固定的物質(zhì)不同,生物芯片可分為基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、細(xì)胞芯片以及組織芯片?；蛐酒?genechip)又稱DNA芯片(DNAchip)或DNA微陣列(DNAmicroarray),是將cDNA或寡核苷酸按微陣列方式固定在微型載體上制成。蛋白質(zhì)芯片(proteinchip或proteinmicroarray)是將蛋白質(zhì)或抗原等一些非核酸生命物質(zhì)按微陣列方式固定在微型載體上獲得。細(xì)胞芯片(cellchip)是將細(xì)胞按照特定的方式固定在載體上,用來檢測細(xì)胞間相互影響或相互作用。組織芯片(tissuechip)是將組織切片等按照特定的方式固定在載體上,用來進(jìn)行免疫組織化學(xué)等組織內(nèi)成分差異研究。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)理論,所有藥物(或獸藥)都是直接或間接地通過修飾、改變?nèi)祟?或相關(guān)動(dòng)物)基因的表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的功能而生效,而生物芯片技術(shù)具有高通量、大規(guī)模、平行性地分析基因表達(dá)或蛋白質(zhì)狀況的能力,在中藥研究方面具有巨大的優(yōu)勢。有助于更加全面、更加快速分析中藥中的活性成分和毒性成分,進(jìn)而提高中藥開發(fā)的效率。5基于基因表達(dá)譜的分析生物芯片可用于預(yù)測不良反應(yīng)如毒性。由于中藥作用機(jī)制的復(fù)雜性,傳統(tǒng)的毒理研究方法需要大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn),確定藥物的潛在毒性時(shí)間長,并且難以對中藥從整體到細(xì)胞水平、甚至蛋白質(zhì)與基因水平進(jìn)行較全面的評價(jià)。而慢性毒性和副作用往往涉及基因或基因表達(dá)的改變。利用基因表達(dá)譜對比研究某種中藥或其提取物作用于動(dòng)物前后,特定細(xì)胞中相關(guān)物質(zhì)功能基因表達(dá)mRNA的異常變化,可提示該中藥在研究劑量下是否具有毒性及產(chǎn)生毒性的作用機(jī)制。生物芯片用于研究中藥的毒副作用可以減少動(dòng)物實(shí)驗(yàn),提高用藥的安全性。使得藥物篩選的靶基因鑒別和新藥測試的速度大大提高,甚至可能在幾