天然抗腫瘤藥物篩選方法的研究進(jìn)展

天然抗腫瘤藥物篩選方法的研究進(jìn)展

腫瘤是一種常見的疾病，嚴(yán)重威脅著人類健康。尋找有效的抗癲癇藥物和方法，徹底攻克癌癥。這是世界上的一個(gè)重要課題。在腫瘤治療中,傳統(tǒng)的放、化療在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí),也造成機(jī)體骨髓抑制和免疫功能低下,毒副作用強(qiáng)大。天然藥無論在減輕臨床癥狀、提高生存質(zhì)量、防止復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、延長生存期,還是在與放化療配合、增效減毒等方面都有很好的效果。為了克服傳統(tǒng)的放、化療所帶來一系列弊病,近年藥學(xué)工作者不斷地探索,應(yīng)用植物藥進(jìn)行治療腫瘤成為了當(dāng)前研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。研究表明,全球應(yīng)用175種抗癌藥物中,有57%直接或間接來源于天然產(chǎn)物。但是全球的高等植物中僅6%做過生物活性篩選,15%經(jīng)過植物化學(xué)的評價(jià),不到10%的藥用植物經(jīng)過詳細(xì)的藥理研究。所以,從天然產(chǎn)物研發(fā)創(chuàng)新藥物的潛能十分巨大。但是如何有效地從數(shù)目龐大的天然產(chǎn)物中找到具有抗腫瘤活性的分子,是目前藥物研發(fā)亟待解決的瓶頸問題之一。因此,需要建立合理的抗腫瘤藥物篩選的方法和系統(tǒng)以及找到更高效、更簡便的篩選模型。本文在系統(tǒng)查閱了國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上,就天然抗腫瘤藥物篩選方法研究進(jìn)展進(jìn)行綜述,以期為天然抗腫瘤藥物篩選研究提供理論依據(jù)和方法學(xué)指導(dǎo)。1動(dòng)物移植腫瘤的檢查方法1.1動(dòng)物獲得結(jié)果迄今為止,動(dòng)物移植性腫瘤實(shí)驗(yàn)法仍是最通用的方法。現(xiàn)有移植性腫瘤接種成功率高達(dá)100%,可在同一時(shí)間內(nèi)獲得大量(幾十至數(shù)百只或更多)生長相對均勻的腫瘤,以供實(shí)驗(yàn)所需。動(dòng)物多選用小鼠,偶亦見大鼠和地鼠,均雌雄皆可,但每批實(shí)驗(yàn)只用一個(gè)性別;一般給藥7~14d,在第8~15天可解剖動(dòng)物獲得結(jié)果。該方法可以判斷在動(dòng)物耐受劑量下,藥物是否有明顯抑制腫瘤生長的作用,這是任何體外試驗(yàn)不能代替的,其結(jié)果可作為判別抗癌藥物臨床療效的有意義的根據(jù)。藥物抗腫瘤篩選時(shí),最好采用3種瘤株,即肉瘤、腹水性腫瘤和白血病株,國內(nèi)常采用S180、艾氏癌腹水型和小鼠白血病株。然而,一種藥物未必對各種類型的動(dòng)物移植性腫瘤都有效,選擇單一瘤株來篩選可能漏篩藥物,特別是動(dòng)物腫瘤的生物學(xué)特點(diǎn)與人的有較大差距時(shí),假陰性的可能性更大。因?yàn)閯?dòng)物瘤株惡性程度高,生長迅速,對藥物的敏感性比人類自發(fā)的癌瘤高得多,因此認(rèn)為本法的命中率低。美國國立癌癥研究所(NCI)為了要尋找對人癌特定細(xì)胞有效的藥物,采用人癌(主要是肺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、肝癌、胃癌等)細(xì)胞株經(jīng)體外試驗(yàn)法初步篩選有效的藥物,然后將人癌細(xì)胞接種到T細(xì)胞免疫缺陷的裸小鼠或免疫抑制小鼠造模,以確證藥物對人癌的作用。我國對新藥在以上第一輪篩選有效的基礎(chǔ)上,也推薦人癌細(xì)胞異種移植模型進(jìn)行第二輪篩選。1.2篩選細(xì)胞毒類藥物目前臨床上常用的抗腫瘤藥大多首先經(jīng)動(dòng)物移植性腫瘤篩選而發(fā)現(xiàn)的,從尋找新藥角度看來,按照我國目前條件和情況,篩選細(xì)胞毒類藥物可選用肉瘤S180實(shí)體性、艾氏癌腹水型(EAC)、肝癌Hep腹水型(HAC)或?qū)嶓w型(H22)、Lewis肺癌LL、白血病P388或L1210、黑色素瘤B16、肉瘤S37、腸癌C38、C26及瓦克癌肉瘤W256等。1.3治療效果評估1.3.1腫瘤抑制率tum要求模型對照組小鼠平均瘤重不小于1g,且不超過20%鼠的瘤重小于0.4g。其療效以腫瘤抑制百分率(Tumorinhibitionratio)表示。計(jì)算方法如下:腫瘤抑制率(%)=(1-T/C)×100%,其中T指給藥組平均瘤重,C指模型對照組平均瘤重。天然藥抑制率大于30%,化學(xué)藥大于40%,且經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有顯著差異時(shí),認(rèn)為有苗頭,需繼續(xù)重復(fù),連續(xù)3次,療效穩(wěn)定,則評定此藥有一定療效。1.3.2兩組生存情況對比實(shí)驗(yàn)期間逐日記錄動(dòng)物的死亡情況。模型對照組動(dòng)物通常在2~3周內(nèi)全部死完,個(gè)別存活時(shí)間太長需剔除,但各組亦應(yīng)相應(yīng)剔除一只。如治療期間模型對照組動(dòng)物于7d內(nèi)死亡超過20%,表示實(shí)驗(yàn)失敗;反之,若對照組20%動(dòng)物存活4周以上,實(shí)驗(yàn)亦應(yīng)作廢。治療組觀察時(shí)間一般為30d(生存超過此限者,仍按30d計(jì)算)。其療效以生長延長率表示,計(jì)算公式如下:生長延長率(%)=(T/C-1)×100%,其中T指給藥組平均存活時(shí)間,C指模型對照組平均存活時(shí)間。2物篩選模型的建立細(xì)胞生物學(xué)、分子藥理學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)等學(xué)科的發(fā)展為藥物篩選提供了新的方向。細(xì)胞水平的藥物篩選模型具有材料用量少、藥物作用機(jī)制比較明確和大規(guī)模篩選等優(yōu)點(diǎn)。目前,在細(xì)胞水平上對抗腫瘤天然藥物的篩選主要是采用選取幾種腫瘤細(xì)胞系,以培養(yǎng)細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?用結(jié)晶紫染色測定法、噻唑藍(lán)(MTT)法、麗絲胺羅丹明B(SRB)法等檢測天然藥物及其提取物或單體的體外抗腫瘤作用。3維持細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞分裂微管(microtubule)是由僅αβ微管蛋白異二聚體聚合而成的管狀聚合物,是真核細(xì)胞骨架的重要組成部分。微管參與許多細(xì)胞功能,包括維持細(xì)胞形態(tài)、胞內(nèi)物質(zhì)的運(yùn)輸、細(xì)胞器的定位、鞭毛和纖毛的運(yùn)動(dòng)、染色體運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞分裂等。無論是促進(jìn)微管蛋白聚合、穩(wěn)定已形成的微管類藥物,還是以抑制微管蛋白聚合類藥物都通過影響腫瘤細(xì)胞的有絲分裂過程,使其生長受到抑制。作用于微管的藥物如紫杉醇(paclitaxel,Taxo1)和長春新堿正是通過上述機(jī)制達(dá)到抗腫瘤目的,且與其他類型藥物相比具有更好的療效。因此,微管已成為腫瘤的臨床治療的有效靶點(diǎn)。4血管內(nèi)皮生長因子vegfr實(shí)體瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移依賴于血管生成。在腫瘤的新生血管是實(shí)體瘤的一個(gè)重要因素,它為腫瘤的生長提供必需的營養(yǎng)和氧氣。在其生成過程中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)以及酪氨酸激酶受體(VEGFR)具有極其重要的作用。目前已發(fā)現(xiàn)有許多天然藥物及其有效成分可以通過多種途徑來抑制腫瘤新生血管的生成,如人參皂苷Rg3、紅素、熊果酸等。5腫瘤的表達(dá)端粒酶是維持端粒長度的逆轉(zhuǎn)錄酶,對細(xì)胞增殖、衰老及永生化和癌變起重要作用,在多數(shù)腫瘤中表達(dá)較高。實(shí)驗(yàn)證明端粒酶與惡性腫瘤密切相關(guān),因此端粒酶已成為當(dāng)前腫瘤治療的靶點(diǎn)之一。6真核生物的dna拓?fù)洚悩?gòu)酶DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(DNAtopoisomerases)是真核細(xì)胞和原核細(xì)胞中的基本酶,廣泛分布于細(xì)胞核內(nèi),通過DNA鏈的切割、轉(zhuǎn)移和再連接來改變DNA的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶在細(xì)胞代謝過程中起著極其重要的作用,如DNA復(fù)制、基因轉(zhuǎn)錄、翻譯、DNA重組和有絲分裂等?？拱┧幬锵矘鋲A(camptothecin)及其衍生物的作用靶點(diǎn)是真核生物DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ,吖啶類化合物、鬼臼毒素類化合物、異黃酮類化合物、阿霉素等則作用于真核生物DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ。這些藥物可通過DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ、Ⅱ引起DNA雙螺旋的一條或兩條鏈的斷裂從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的死亡。7信號(hào)傳導(dǎo)通路靶向細(xì)胞的活性受外部信號(hào)控制,外部信號(hào)傳入細(xì)胞內(nèi)部會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)的一系列反應(yīng),這一過程稱為信號(hào)傳導(dǎo)。在腫瘤生長、轉(zhuǎn)移過程中起重要作用的一些生長因子及其受體都是通過信號(hào)傳導(dǎo)起作用的。細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)異常,會(huì)導(dǎo)致惡性腫瘤快速增殖、無限生長。隨著近年來分子腫瘤學(xué)、分子藥理學(xué)的發(fā)展,信號(hào)傳導(dǎo)在腫瘤形成過程中的作用機(jī)制正在逐步被闡明,信號(hào)傳導(dǎo)通路已成為抗腫瘤藥物研究的新靶點(diǎn)。近年來,部分抗腫瘤藥物的研發(fā)已從傳統(tǒng)的細(xì)胞毒藥物轉(zhuǎn)移到針對腫瘤細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路的新型抗腫瘤藥物。正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞在多種信號(hào)傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵組分間存在巨大差異,因此靶向這些組分的抗腫瘤藥物具有高選擇性、高效、低毒的特征。目前,藥物干預(yù)腫瘤細(xì)胞信號(hào)通路主要是通過環(huán)腺嘌呤核苷酸-蛋白激酶A通路、酶聯(lián)受體信號(hào)通路、磷脂酰肌醇信號(hào)通路、鈣和鈣調(diào)蛋白通路等幾個(gè)通路實(shí)現(xiàn)。8細(xì)胞凋亡deat細(xì)胞凋亡(apoptosis)是基因調(diào)控下的細(xì)胞主動(dòng)死亡,這一過程又稱程序化細(xì)胞死亡(programmedcelldeath)。細(xì)胞凋亡伴隨著細(xì)胞質(zhì)濃縮,細(xì)胞核崩裂,微粒消失,細(xì)胞膜皺縮,染色質(zhì)濃縮繼而解體,DNA裂解,最后形成凋亡小體。細(xì)胞增殖、分化和凋亡調(diào)節(jié)系統(tǒng)的失常將導(dǎo)致細(xì)胞惡性生長分裂。研究發(fā)現(xiàn),許多抗腫瘤藥物均通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來發(fā)揮抗腫瘤作用。9瘤細(xì)胞即誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)分化治療是腫瘤治療研究的新途徑。其基本特點(diǎn)在于不是殺傷腫瘤細(xì)胞而是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化為正?；蚪咏＜?xì)胞。自20世紀(jì)80年代國際分化治療會(huì)議舉行以來,腫瘤誘導(dǎo)分化治療已成為了國際腫瘤研究的一個(gè)熱點(diǎn),誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化及逆轉(zhuǎn)是當(dāng)前腫瘤分子生物學(xué)中一個(gè)重要的研究領(lǐng)域。10其它常用的篩選方法正確的研究方法和科學(xué)的思路在天然藥物抗腫瘤的實(shí)驗(yàn)研究中起關(guān)鍵的作用,體內(nèi)動(dòng)物移植瘤實(shí)驗(yàn)、體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、作用微管蛋白的天然抗腫瘤藥物的篩選方法、應(yīng)用腫瘤新生血管生成抑