一測多評法測定黃芪中4種異黃酮類成分

一測多評法測定黃芪中4種異黃酮類成分

黃鼠狼（astagaliradix）的名字來自蒙古的astagalemembregi（b）；var.meb.a.h垂直屬c或膜寧夏a.meblaceus（b）。干燥的根，其中蒙古黃鼠狼是其主要品種。黃芪的主要活性成分為黃酮類、皂苷類和多糖類化合物。研究表明,黃芪中的黃酮類化合物具有調(diào)節(jié)免疫、抗病毒、清除自由基等多方面的藥理作用,其中含量較高的主要為異黃酮苷類成分(毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷)及其相應(yīng)的苷元(毛蕊異黃酮、芒柄花素)。中藥的多成分、多功效的作用特點,決定著單一成分難以表達中藥的質(zhì)量,因此,多成分多指標(biāo)含量測定是當(dāng)前國際上廣泛認可的質(zhì)量評價模式。迄今為止,已有通過同步測定以上4種異黃酮類成分對黃芪進行質(zhì)量控制的報道。但毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷等對照品的供應(yīng)不足嚴(yán)重限制了多成分含量測定法在實際生產(chǎn)和市場監(jiān)督中的應(yīng)用。對此,本文應(yīng)用“一測多評”法(quantitativeanalysisofmulti-componentsbysinglemarker,QAMS)實現(xiàn)黃芪多指標(biāo)質(zhì)量控制,即應(yīng)用其中1個對照品易獲得的成分(芒柄花素),通過建立該成分與其余待測成分(毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮)間的相對校正因子,計算出其余成分的含量,實現(xiàn)多指標(biāo)質(zhì)量控制。1高效液相色譜法測定電子在ag采用phenose-cs/ms-3-b211d電子文件1.Agilent1100高效液相色譜儀(G1312ABinPump,G1322ADegasser,G1367AWPALS,G1315BDAD),Agilent1200高效液相色譜儀(G1311AQuatPump,G1322ADegasser,G1329AALS,G1314BVWD),ChemStation色譜工作站,AgilentExtend-C18(4.6mm×250mm,5μm),PhenomenexGemini-C18(4.6mm×250mm,5μm),HederaODS-2(4.6mm×250mm,5μm),ShimpackCLC-ODS(6.0mm×150mm)。BP211D電子分析天平(Sartorius)。AgilentLC-Q-TOFMS系統(tǒng)(Agilent1200高效液相色譜儀,ESI離子源,AgilentLC-MS-Q-TOFVer.A.01.00,AgilentMassHunterWorkstationSoftwareQualitativeAnalysisB.02.00)。毛蕊異黃酮苷(calycosin-7-O-β-D-glucopyranoside,CG)、芒柄花苷(ononin,ON)、毛蕊異黃酮(calycosin,CL)、芒柄花素(formononetin,FO)4種對照品均由實驗室自制,結(jié)構(gòu)經(jīng)1H-NMR,13C-NMR,以及MS確證,HPLC(峰面積歸一化法)純度均>98%。乙腈為色譜純,水為Milli-Q超純水,其他試劑均為分析純。黃芪藥材及飲片購自全國各地,經(jīng)本校李萍教授鑒定為蒙古黃芪A.membranaceusvar.mongholicus或膜莢黃芪A.membranaceus的干燥根。2方法和結(jié)果2.1毛用明酮含量測定在一定范圍(線性范圍)內(nèi)成分的量(質(zhì)量或濃度)與檢測器響應(yīng)成正比,即W=fA,可得響應(yīng)因子f=WA①f=WA①。在黃芪多指標(biāo)質(zhì)量評價時,以藥材中芒柄花素為內(nèi)標(biāo),建立其與毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮之間的校正因子,通過校正因子計算毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮的含量。校正因子fk/m定義如下:fk/m=fkfm=Wk×AmWm×Akfk/m=fkfm=Wk×AmWm×Ak②由此可導(dǎo)出定量計算公式:Wm=Wk×Amfk/m×AkWm=Wk×Amfk/m×Ak③式中Ak為內(nèi)標(biāo)物峰面積,Wk為內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量。Am為其他組分m的峰面積;Wm為其他組分m的質(zhì)量。在實際測定時,用外標(biāo)法測定芒柄花素的含量,再通過校正因子計算毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮的含量,同時用常規(guī)外標(biāo)法進行同步測定,以驗證計算值的正確性和可行性。2.2方法研究2.2.1abb3%苯甲酸水溶液anb的溶液洗脫程序℃;流速1.0mL·min-1;檢測波長248nm,258nm;流動相:0.3%甲酸水溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脫程序0~12min,20~37B%;12~16min,37~40B%;16~22min,40~50B%;22~28min,50~100B%。上述色譜條件下,各組分分離度良好,見圖1。2.2.2l量瓶內(nèi)固相瓶中l(wèi)量瓶的檢測分別精密稱定毛蕊異黃酮苷2.42mg,芒柄花苷1.53mg,各置于5mL量瓶中;毛蕊異黃酮2.61mg,芒柄花素1.56mg,各置于10mL量瓶中,用甲醇溶解稀釋至刻度,制得各單一對照品溶液,分別量取不同體積單一對照品溶液,混合稀釋制成系列濃度混合對照品溶液,保存于4℃冰箱,備用。2.2.3制備多孔多孔多孔耐氧體膜取黃芪干燥粉末約1g(過60目篩),精密稱定,置圓底燒瓶中,加甲醇50mL,加熱回流4h,放冷,濾過,濾液回收甲醇至小體積,轉(zhuǎn)移至5mL量瓶中,加甲醇定容至刻度,搖勻,過0.22μm微孔濾膜,棄去初濾液,取續(xù)濾液備用。2.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立將2.2.2項下制得的混合對照品溶液,每個濃度進樣3次,各進樣10μL,以進樣量(X,μg)為橫坐標(biāo),平均峰面積(Y)為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線,并以最小二乘法計算回歸方程,見表1。2.2.5條件三:藥劑免疫因子根據(jù)2.1項中公式①,②,結(jié)合2.2.4項所用系列濃度對照品溶液所得峰面積數(shù)據(jù),計算毛蕊異黃酮苷(CG)、芒柄花苷(ON)、毛蕊異黃酮(CL)與芒柄花素(FO)之間的校正因子如下:fFO/CG=fFOfCG=0.4801?fFO/ON=fFOfON=0.5578?fFO/CL=fFOfCL=0.8565fFΟ/CG=fFΟfCG=0.4801?fFΟ/ΟΝ=fFΟfΟΝ=0.5578?fFΟ/CL=fFΟfCL=0.8565。2.2.6互相配合的藥劑取線性關(guān)系項下高、中、低3個濃度的對照品溶液,于1d內(nèi)每個濃度連續(xù)進3針,所得峰面積的RSD為日內(nèi)精密度,毛蕊異黃酮苷峰面積RSD分別為0.10%,1.10%,0.90%;芒柄花苷分別為0.60%,1.20%,0.60%;毛蕊異黃酮分別為1.00%,0.40%,0.70%;芒柄花素分別為0.10%,1.10%,0.90%。取1個濃度的對照品溶液,連續(xù)3d,每天進3針,所得峰面積的RSD為日間精密度,毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素峰面積的RSD分別為2.2%,0.60%,1.1%,0.60%,表明儀器的精密度良好。2.2.7重復(fù)性的測定稱取黃芪(HQ13)干燥粉末(過60目篩)約1g,共6份,精密稱定,按2.2.3項下制備樣品,測定6份樣品中毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.0187%,0.0087%,0.0231%,0.0160%,RSD分別為2.8%,2.8%,2.9%,2.6%(n=6),表明該方法的重復(fù)性良好。2.2.8溶液穩(wěn)定性試驗取同一供試品溶液(HQ13),分別放置0,2,4,6,8,12,24,48h后進樣分析,每次進樣10μL,記錄峰面積,毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素峰面積的RSD分別為2.8%,1.5%,0.6%,0.5%,表明供試品溶液在48h內(nèi)穩(wěn)定。2.2.9加樣回收率試驗精密稱取適量含量已知的黃芪藥材(HQ13)粉末(過60目篩)9份,每份約0.5g,精密稱定,隨機分為3組,每組按照藥材含量80%,100%,120%的比例分別加入毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素對照品,加入甲醇補足至50mL,按2.2.3項下制備樣品,測定,計算加樣回收率,毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素的加樣回收率分別為99.8%,100.7%,100.3%,101.6%,RSD分別為2.7%,2.2%,3.0%,2.8%。2.3修正因素的系統(tǒng)適應(yīng)性研究2.3.1高效液相色譜測定取2.2.2項下系列混合對照品溶液,進樣10μL測定,按2.2.5項下分別計算毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮與芒柄花素間的校正因子。使用同一高效液相色譜儀(Agilent1100)考察了4根不同型號色譜柱AgilentExtendC18(4.6mm×250mm,5μm),PhenomenexGemini-C18(4.6mm×250mm,5μm),HederaODS-2(4.6mm×250mm,5μm),ShimpackCLC-ODS(6.0mm×150mm)測定的校正因子。并進一步考察了Agilent1100,Agilent1200和ShimadzuLC-10AT3臺不同高效液相色譜系統(tǒng),其中Agilent1100檢測器為DAD,檢測波長為248nm,258nm;Agilent1200檢測器為可變波長檢測器VWD,使用程序波長:0~11min,258nm,11~28min,248nm;ShimadzuLC-10AT為單波長紫外檢測器,檢測波長為248nm,258nm,見表2。2.3.2色譜峰的確定“一測多評”法在實際應(yīng)用中,利用相對校正因子計算含量,無需用到部分待測組分的對照品,但勢必會遇到如何對這些組分的色譜峰進行定位的問題。中藥成分復(fù)雜,色譜圖中除待測組分色譜峰外,還存在多個其他色譜峰,因此對待測組分色譜峰的正確定位是準(zhǔn)確測定的前提?？疾炝舜郎y組分與內(nèi)參物保留時間差值的變化情況見表3。4種成分在不同色譜柱和色譜儀上保留時間有所差別,但芒柄花素相對于其他3種成分的保留時間差值變化不大。為此,選擇采用待測組分與內(nèi)參物保留時間的差值定位。實驗所得芒柄花素與毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮的保留時間差分別為15.853,10.756,7.800,可供參考。采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對上述色譜峰定位進行了驗證。對待測組分色譜峰的質(zhì)譜分析結(jié)果見圖2,表明色譜峰定位正確;進一步比較4個對照品與樣品中對應(yīng)峰的質(zhì)譜圖,結(jié)果二者一致,由此可判斷藥材中這4個成分的色譜峰和其他成分完全分開,無雜質(zhì)干擾,可進行準(zhǔn)確定量。在本“一測多評”法的實際應(yīng)用中,可參考藥材典型色譜圖,并計算待測組分與內(nèi)參物的保留時間差值,同時結(jié)合化合物的紫外吸收特征,基本能夠正確判斷出目標(biāo)峰的位置。2.4兩個樣本含量比較按2.2.3制備22批黃芪藥材(編號HQ01~HQ22)和12批黃芪飲片(編號HQP01~HQP12),分別進樣10μL,平行測定3次,采用外標(biāo)法和QAMS法分別計算毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素的含量。分別用夾角余弦值、Pearson系數(shù)與相關(guān)系數(shù)對兩法所得含量進行比較,結(jié)果表明兩法所得含量相似性極高;另其含量間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差亦在3.5%以內(nèi),表明2種含量測定方法無顯著性差異,QAMS在黃芪的多指標(biāo)成分質(zhì)量評價中應(yīng)用是可行的,見表4。3討論3.1保留時間差值波動芒柄花素對照品市場上可購得,且實驗發(fā)現(xiàn),以芒柄花素為內(nèi)參物,在不同色譜柱和不同儀器上保留時間差值波動最小,均在5%以內(nèi),而若以毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷或毛蕊異黃酮為內(nèi)參物,保留時間差值的波動均大于5%,不宜進行待測組分色譜峰的定位。故最終確定以芒柄花素為內(nèi)參物,建立了黃芪中4個異黃酮類成分的“一測多評”方法。3.2高效液相色譜法為考察不同儀器和色譜柱對校正因子的影響,本實驗分別考察了Agilent1100、Agilent1200及ShimadzuLC-10AT3臺高效液相色譜儀,和4根不同品牌的色譜柱。發(fā)現(xiàn)芒柄花苷、毛蕊異黃酮校正因子較穩(wěn)定,而毛蕊異黃酮苷在不同色譜儀上所得校正因子偏差較大,可能與該化合物的響應(yīng)有關(guān)。3.3相似度評價方法對比本實驗用外標(biāo)法所得含量實測值與QAMS法所得計算值進行比較,評價QAMS的準(zhǔn)確性和科學(xué)性。目前用于相似度評價方法主要有夾角余弦值法、相關(guān)系數(shù)法、Pearson系數(shù)等,各種相似度評價方法有各自的特點和不足。本實驗分別計算夾角余弦值、相關(guān)系數(shù)和Pearson系數(shù),比較實測值和計算值的貼近程度。3種方法均顯示兩組數(shù)據(jù)有極高的相似性,且夾角余弦值對數(shù)據(jù)波動較靈敏。同時兩組數(shù)據(jù)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均在3.5%以內(nèi),表明兩種含量測定方法之間無顯著性差異。3.4提取方式的確定考察了純甲醇、80%甲醇、50%甲醇和純乙醇等溶劑對黃芪中4種異黃酮類成分提取效率的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)純甲醇對4種異黃酮類成分的提取效率均較高,且提出雜質(zhì)較少。進一步以純甲醇為提取溶劑,比較超聲和回流2種提取方式對4種異黃酮類成分提取效率的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)回流明顯高于超聲提取,且超聲提取的穩(wěn)定性