納他霉素與山梨酸復(fù)配對(duì)mrs培養(yǎng)基中真菌生長(zhǎng)的影響

納他霉素與山梨酸復(fù)配對(duì)mrs培養(yǎng)基中真菌生長(zhǎng)的影響

蘑菇通常通過(guò)mrs培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，但蘑菇、細(xì)菌和其他常見(jiàn)細(xì)菌很容易在培養(yǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。mrs培養(yǎng)基用于過(guò)濾和分離蘑菇，并計(jì)算蘑菇的計(jì)數(shù)是不理想的。因此，可以在mrs培養(yǎng)基中添加抑制細(xì)菌和其他常見(jiàn)細(xì)菌，但不影響蘑菇生長(zhǎng)，從而優(yōu)化mrs培養(yǎng)基。在MRS培養(yǎng)基中添加放線菌酮,對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)沒(méi)有影響,但可抑制真菌,因其價(jià)格較昂貴而實(shí)際應(yīng)用受到一定限制。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)添加不同濃度納他霉素(Natamycin)與山梨酸(SorbicAcid)及其復(fù)配后在MRS培養(yǎng)基中防止雜菌生長(zhǎng)情況的研究,初步獲得了改良MRS培養(yǎng)基。1材料和方法1.1植物菌種培養(yǎng)大腸桿菌(Escherichaecoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、藤黃微球菌(Micrococcusluteus)、啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantrum)和乳鏈球菌(Streptococcuslactis):均保存于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏工程省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基;PDA液體培養(yǎng)基;PDA斜面培養(yǎng)基;MRS培養(yǎng)基;山梨酸(AR級(jí));納他霉素(食品級(jí),含量50%)。1.2細(xì)菌生長(zhǎng)特性的測(cè)定采用防腐劑稀釋平板法測(cè)定納他霉素和山梨酸以及兩者復(fù)配后對(duì)測(cè)試微生物的最低抑菌濃度(MIC)。準(zhǔn)確稱取0.1g納他霉素于100mL無(wú)菌蒸餾水中,配成0.05%的納他霉素懸濁液,于棕色瓶中存放,現(xiàn)用現(xiàn)配。同時(shí)準(zhǔn)確稱取1g山梨酸溶于20mL無(wú)水乙醇,制成5%的溶液待用。測(cè)試用細(xì)菌、酵母菌、霉菌、乳酸菌分別用肉湯培養(yǎng)基、PDA液體培養(yǎng)基、PDA斜面培養(yǎng)基、MRS液體培養(yǎng)基進(jìn)行活化,并制備成106cfu/mL的菌(孢子)懸液。將不同濃度的納他霉素和山梨酸加至冷卻至45℃的定量MRS培養(yǎng)基中,混合均勻,傾注平板,瓊脂凝固后即為含不同濃度納他霉素和山梨酸以及二者混合物的平板。每種菌(孢子)懸液用移液器準(zhǔn)確移取5μL接種于含防腐劑的MRS平板上,做3次重復(fù),同時(shí)用不含任何防腐劑的MRS平板做空白對(duì)照,細(xì)菌于37℃、真菌于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h、48h、72h,觀察各種菌的生長(zhǎng)情況。以某菌在平板上未生長(zhǎng)的最低防腐劑濃度判定為某菌對(duì)該種防腐劑的MIC。2結(jié)果與分析2.1納他激素對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響由表1可以看出,隨著納他霉素濃度的增加,對(duì)霉菌和酵母菌的抑制作用增強(qiáng),但對(duì)大腸桿菌等細(xì)菌卻沒(méi)有任何抑制作用。當(dāng)納他霉素達(dá)到10mg/L時(shí),米曲霉和啤酒酵母的生長(zhǎng)受到抑制,而植物乳桿菌和乳酸鏈球菌的生長(zhǎng)良好。因此,納他霉素對(duì)米曲霉和啤酒酵母的MIC為10mg/L。2.2山梨酸達(dá)到20cm/l的情況由表2可以看出,隨著山梨酸濃度的增大,對(duì)大腸桿菌等細(xì)菌和真菌的抑制作用明顯增強(qiáng),當(dāng)山梨酸達(dá)到2000mg/L時(shí),除植物乳桿菌和乳酸鏈球菌外,其他測(cè)試雜菌的生長(zhǎng)均受到有效抑制。因此,山梨酸對(duì)測(cè)試的米曲霉、啤酒酵母、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌菌株均有抑制作用的MIC為2000mg/L。2.3納他激素對(duì)山梨酸復(fù)配的協(xié)同增效作用單獨(dú)使用10mg/L納地霉素能抑制測(cè)試的真菌,但對(duì)細(xì)菌無(wú)任何抑制作用;單獨(dú)使用2000mg/L山梨酸可以抑制測(cè)試的常見(jiàn)細(xì)菌及真菌的生長(zhǎng)。因此,采用2因素3水平的正交試驗(yàn)考察二者復(fù)配后的抑菌效果,結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可以看出,納他霉素與山梨酸所有組合濃度對(duì)測(cè)試的乳酸菌的生長(zhǎng)均無(wú)影響。5mg/L納他霉素與1000mg/L山梨酸復(fù)配時(shí),對(duì)枯草芽孢桿菌和米曲霉有抑制作用;5mg/L納他霉素與1500mg/L山梨酸復(fù)配時(shí),除啤酒酵母以外的雜菌均有抑制作用;7.5mg/L納他霉素與1000mg/L山梨酸復(fù)配時(shí),對(duì)枯草芽孢桿菌,金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌有明顯抑制作用,對(duì)大腸桿菌和米曲霉有部分抑制效果,但并不能抑制啤酒酵母的生長(zhǎng)。除上述外的所有濃度組合都能完全抑制測(cè)試的常見(jiàn)細(xì)菌和真菌的生長(zhǎng),同時(shí),隨著納他霉素濃度由5mg/L增加到10mg/L,山梨酸的濃度從2000mg/L降低到1000mg/L,均能有效地抑制測(cè)試的微生物菌種。試驗(yàn)結(jié)果表明,將納他霉素和山梨酸復(fù)配后具有協(xié)同增效作用,并且可以降低使用濃度,最佳的濃度組合為5mg/L納他霉素與2000mg/L山梨酸;7.5mg/L納他霉素與1500mg/L山梨酸;10mg/L納他霉素與1000mg/L山梨酸。3山梨酸的抑菌作用據(jù)報(bào)道,納他霉素對(duì)幾乎所有的霉菌和酵母菌都具有抑制作用,但對(duì)細(xì)菌和病毒則不起作用。研究表明,大多數(shù)霉菌被質(zhì)量濃度為1.0×10-3g/L~6.0×10-3g/L的納他霉素抑制,極個(gè)別的霉菌在質(zhì)量濃度為1.0×10-2g/L~2.5×10-2g/L的納他霉素條件下被抑制;大多數(shù)酵母菌在納他霉素質(zhì)量濃度為1.0×10-3g/L~5.0×10-3g/L時(shí)被抑制。試驗(yàn)中納他霉素對(duì)測(cè)試真菌的MIC稍微偏高,可能與納他霉素在微酸性MRS培養(yǎng)基中的抗菌活性受到一定影響有關(guān)。山梨酸是一種酸性防腐劑,其抑菌機(jī)制主要與其分子態(tài)的數(shù)量有關(guān),抑菌效果受介質(zhì)pH值的影響較大。這是由于在酸性環(huán)境下它以分子態(tài)存在,更易通過(guò)微生物細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)而起到抑菌作用;而在pH值較高時(shí),多數(shù)以離解的狀態(tài)存在,不易通過(guò)微生物細(xì)胞膜起作用,抑菌效果受到一定影響。通常山梨酸的最佳抑菌pH值范圍在5.6以下,而MRS培養(yǎng)基的pH值為6.2左右,并不是山梨酸的最佳抑菌pH值范圍。由于山梨酸不但可以有效抑制霉菌及酵母等真菌,同時(shí)對(duì)細(xì)菌也有一定的抑制作用,所以考慮將山梨酸用于MRS培養(yǎng)基中可抑制部分細(xì)菌的生長(zhǎng)。魏寶東等(2004年)指出,山梨酸的抑菌效果遠(yuǎn)不及納他霉素,僅為納他霉素的1/50~1/100。試驗(yàn)中山梨酸對(duì)測(cè)試雜菌均有抑制作用的MIC為2000mg/L,為納他霉素的200倍,這與山梨酸在微酸性MRS培養(yǎng)基中的抗菌活性較弱有關(guān)。同時(shí),實(shí)驗(yàn)表明納他霉素和山梨酸復(fù)配后具有協(xié)同增效作用,并且可以降低二者的使用濃度。這與SAMPAYO(1995年)報(bào)道用納他霉素和山梨酸鉀復(fù)配使用可對(duì)乳酪起到較好的防腐作用,其原因可能是二者復(fù)配后抑菌譜被拓寬所致相一致。國(guó)內(nèi)對(duì)于改良乳酸菌培養(yǎng)基有一定的報(bào)道,朱寶玉等(2004年)通過(guò)向TJA培養(yǎng)基中加入硫酸多粘菌素(10萬(wàn)U/L)和放線菌酮(10mg/L)來(lái)改良乳酸菌選擇性培養(yǎng)基,改良后的培養(yǎng)基可以抑制除乳酸菌外的雜菌,同時(shí)對(duì)乳酸菌沒(méi)有影響;張春輝等(2002年)在研究酒類酒球菌分離培養(yǎng)基時(shí)得出,向改良MRS添加50mg/L放線菌酮或100mg/L山梨酸或50mg/L制霉菌素,能夠完全抑制釀酒酵母的生長(zhǎng)。4納他激素與山梨酸復(fù)配試驗(yàn)中單獨(dú)添