納他霉素與山梨酸復配對mrs培養(yǎng)基中真菌生長的影響

納他霉素與山梨酸復配對mrs培養(yǎng)基中真菌生長的影響

蘑菇通常通過mrs培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，但蘑菇、細菌和其他常見細菌很容易在培養(yǎng)培養(yǎng)基中生長。mrs培養(yǎng)基用于過濾和分離蘑菇，并計算蘑菇的計數是不理想的。因此，可以在mrs培養(yǎng)基中添加抑制細菌和其他常見細菌，但不影響蘑菇生長，從而優(yōu)化mrs培養(yǎng)基。在MRS培養(yǎng)基中添加放線菌酮,對乳酸菌生長沒有影響,但可抑制真菌,因其價格較昂貴而實際應用受到一定限制。本實驗通過對添加不同濃度納他霉素(Natamycin)與山梨酸(SorbicAcid)及其復配后在MRS培養(yǎng)基中防止雜菌生長情況的研究,初步獲得了改良MRS培養(yǎng)基。1材料和方法1.1植物菌種培養(yǎng)大腸桿菌(Escherichaecoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、藤黃微球菌(Micrococcusluteus)、啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantrum)和乳鏈球菌(Streptococcuslactis):均保存于四川農業(yè)大學農產品加工與貯藏工程省級重點實驗室;營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基;PDA液體培養(yǎng)基;PDA斜面培養(yǎng)基;MRS培養(yǎng)基;山梨酸(AR級);納他霉素(食品級,含量50%)。1.2細菌生長特性的測定采用防腐劑稀釋平板法測定納他霉素和山梨酸以及兩者復配后對測試微生物的最低抑菌濃度(MIC)。準確稱取0.1g納他霉素于100mL無菌蒸餾水中,配成0.05%的納他霉素懸濁液,于棕色瓶中存放,現用現配。同時準確稱取1g山梨酸溶于20mL無水乙醇,制成5%的溶液待用。測試用細菌、酵母菌、霉菌、乳酸菌分別用肉湯培養(yǎng)基、PDA液體培養(yǎng)基、PDA斜面培養(yǎng)基、MRS液體培養(yǎng)基進行活化,并制備成106cfu/mL的菌(孢子)懸液。將不同濃度的納他霉素和山梨酸加至冷卻至45℃的定量MRS培養(yǎng)基中,混合均勻,傾注平板,瓊脂凝固后即為含不同濃度納他霉素和山梨酸以及二者混合物的平板。每種菌(孢子)懸液用移液器準確移取5μL接種于含防腐劑的MRS平板上,做3次重復,同時用不含任何防腐劑的MRS平板做空白對照,細菌于37℃、真菌于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h、48h、72h,觀察各種菌的生長情況。以某菌在平板上未生長的最低防腐劑濃度判定為某菌對該種防腐劑的MIC。2結果與分析2.1納他激素對酵母菌生長的影響由表1可以看出,隨著納他霉素濃度的增加,對霉菌和酵母菌的抑制作用增強,但對大腸桿菌等細菌卻沒有任何抑制作用。當納他霉素達到10mg/L時,米曲霉和啤酒酵母的生長受到抑制,而植物乳桿菌和乳酸鏈球菌的生長良好。因此,納他霉素對米曲霉和啤酒酵母的MIC為10mg/L。2.2山梨酸達到20cm/l的情況由表2可以看出,隨著山梨酸濃度的增大,對大腸桿菌等細菌和真菌的抑制作用明顯增強,當山梨酸達到2000mg/L時,除植物乳桿菌和乳酸鏈球菌外,其他測試雜菌的生長均受到有效抑制。因此,山梨酸對測試的米曲霉、啤酒酵母、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌菌株均有抑制作用的MIC為2000mg/L。2.3納他激素對山梨酸復配的協(xié)同增效作用單獨使用10mg/L納地霉素能抑制測試的真菌,但對細菌無任何抑制作用;單獨使用2000mg/L山梨酸可以抑制測試的常見細菌及真菌的生長。因此,采用2因素3水平的正交試驗考察二者復配后的抑菌效果,結果見表3。由表3可以看出,納他霉素與山梨酸所有組合濃度對測試的乳酸菌的生長均無影響。5mg/L納他霉素與1000mg/L山梨酸復配時,對枯草芽孢桿菌和米曲霉有抑制作用;5mg/L納他霉素與1500mg/L山梨酸復配時,除啤酒酵母以外的雜菌均有抑制作用;7.5mg/L納他霉素與1000mg/L山梨酸復配時,對枯草芽孢桿菌,金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌有明顯抑制作用,對大腸桿菌和米曲霉有部分抑制效果,但并不能抑制啤酒酵母的生長。除上述外的所有濃度組合都能完全抑制測試的常見細菌和真菌的生長,同時,隨著納他霉素濃度由5mg/L增加到10mg/L,山梨酸的濃度從2000mg/L降低到1000mg/L,均能有效地抑制測試的微生物菌種。試驗結果表明,將納他霉素和山梨酸復配后具有協(xié)同增效作用,并且可以降低使用濃度,最佳的濃度組合為5mg/L納他霉素與2000mg/L山梨酸;7.5mg/L納他霉素與1500mg/L山梨酸;10mg/L納他霉素與1000mg/L山梨酸。3山梨酸的抑菌作用據報道,納他霉素對幾乎所有的霉菌和酵母菌都具有抑制作用,但對細菌和病毒則不起作用。研究表明,大多數霉菌被質量濃度為1.0×10-3g/L~6.0×10-3g/L的納他霉素抑制,極個別的霉菌在質量濃度為1.0×10-2g/L~2.5×10-2g/L的納他霉素條件下被抑制;大多數酵母菌在納他霉素質量濃度為1.0×10-3g/L~5.0×10-3g/L時被抑制。試驗中納他霉素對測試真菌的MIC稍微偏高,可能與納他霉素在微酸性MRS培養(yǎng)基中的抗菌活性受到一定影響有關。山梨酸是一種酸性防腐劑,其抑菌機制主要與其分子態(tài)的數量有關,抑菌效果受介質pH值的影響較大。這是由于在酸性環(huán)境下它以分子態(tài)存在,更易通過微生物細胞膜進入細胞內而起到抑菌作用;而在pH值較高時,多數以離解的狀態(tài)存在,不易通過微生物細胞膜起作用,抑菌效果受到一定影響。通常山梨酸的最佳抑菌pH值范圍在5.6以下,而MRS培養(yǎng)基的pH值為6.2左右,并不是山梨酸的最佳抑菌pH值范圍。由于山梨酸不但可以有效抑制霉菌及酵母等真菌,同時對細菌也有一定的抑制作用,所以考慮將山梨酸用于MRS培養(yǎng)基中可抑制部分細菌的生長。魏寶東等(2004年)指出,山梨酸的抑菌效果遠不及納他霉素,僅為納他霉素的1/50~1/100。試驗中山梨酸對測試雜菌均有抑制作用的MIC為2000mg/L,為納他霉素的200倍,這與山梨酸在微酸性MRS培養(yǎng)基中的抗菌活性較弱有關。同時,實驗表明納他霉素和山梨酸復配后具有協(xié)同增效作用,并且可以降低二者的使用濃度。這與SAMPAYO(1995年)報道用納他霉素和山梨酸鉀復配使用可對乳酪起到較好的防腐作用,其原因可能是二者復配后抑菌譜被拓寬所致相一致。國內對于改良乳酸菌培養(yǎng)基有一定的報道,朱寶玉等(2004年)通過向TJA培養(yǎng)基中加入硫酸多粘菌素(10萬U/L)和放線菌酮(10mg/L)來改良乳酸菌選擇性培養(yǎng)基,改良后的培養(yǎng)基可以抑制除乳酸菌外的雜菌,同時對乳酸菌沒有影響;張春輝等(2002年)在研究酒類酒球菌分離培養(yǎng)基時得出,向改良MRS添加50mg/L放線菌酮或100mg/L山梨酸或50mg/L制霉菌素,能夠完全抑制釀酒酵母的生長。4納他激素與山梨酸復配試驗中單獨添