發(fā)酵工程制藥-發(fā)酵染菌及防治

染菌的原因及防治原因很多，歸納起來主要有：一、染菌的原因人為操作不當滅菌不徹底設(shè)備滲漏種子保藏不當帶菌無菌空氣帶菌（一）種子帶菌的原因及防治培養(yǎng)基及用具滅菌不徹底菌種在移種過程中受污染菌種在培養(yǎng)或保藏過程中受污染1、培養(yǎng)基及用具滅菌不徹底原因滅菌鍋內(nèi)空氣排放不完全，造成假壓，使滅菌時溫度達不到要求。防止方法滅菌時鍋內(nèi)排氣完全。2、菌種在移接過程中受污染原因接種時操作不當，或無菌室管理不嚴。預(yù)防方法合理設(shè)計無菌室，規(guī)范無菌室管理制度，嚴格進行無菌操作。3、菌種在培養(yǎng)過程或保藏過程中受污染原因菌種在培養(yǎng)或保藏過程中，由于外界空氣進入，也使雜菌進入而受污染。防止方法試管的棉塞應(yīng)有一定的松緊度，不宜太松且有一定的長度；培養(yǎng)和保藏溫度變化不宜太大；每一級種子經(jīng)檢查合格后才能使用。（二）無菌空氣帶菌及防治在好氧發(fā)酵中通入的無菌空氣帶菌是發(fā)酵污染菌的主要原因之一原因過濾器失效、空氣過濾器質(zhì)量、高效濾芯的安裝質(zhì)量、無菌空氣帶油帶水預(yù)防方法空氣凈化流程和設(shè)備的設(shè)計要合理，過濾介質(zhì)的選用和裝填恰當過濾介質(zhì)的滅菌和管理有效特點批批染菌、罐罐染菌。（三）設(shè)備滲漏或設(shè)備、管道存在“死角”造成的染菌及防治1、設(shè)備滲漏引起的染菌及防治發(fā)酵設(shè)備、管道、閥門的長期使用，由于腐蝕、磨擦和振動等原因，往往造成滲漏，從而引起染菌。包括：夾套、盤管、接種管穿孔，閥門、攪拌軸、罐蓋以及其它設(shè)備滲漏等。特點往往每批染菌發(fā)生的時間逐漸提前。預(yù)防方法選用優(yōu)質(zhì)材料，并經(jīng)常進行檢查。2、設(shè)備、管道存在“死角”造成的染菌及防治“死角”：由于操作、設(shè)備結(jié)構(gòu)、安裝或人為造成的屏障等原因，引起蒸汽不能有效充分到達預(yù)定的局部滅菌部位，從而達不到徹底滅菌的要求。這些部位即為“死角”。“死角”可以是設(shè)備、管道的某一部位，也可以是培養(yǎng)基或其它物料的某一部分。（1）不銹鋼襯里破裂形成“死角”；（2）發(fā)酵罐底部培養(yǎng)基的沉積污垢形成“死角”；（4）管道轉(zhuǎn)彎處形成的“死角”；（5）法蘭連接不當造成“死角”。防治：主要從清洗和滅菌來防治。（四）培養(yǎng)基滅菌不徹底導(dǎo)致染菌及防治原料性狀及滅菌技術(shù)的好壞影響滅菌質(zhì)量。1、原料性狀稀薄的培養(yǎng)基易滅菌徹底；而淀粉質(zhì)原料特別是有顆粒時易滅菌不徹底或是升溫過快或混合不均時，易結(jié)塊，使中心部位在滅菌時“夾生”，導(dǎo)致在發(fā)酵過程中團塊散開而染菌。防止措施：淀粉質(zhì)培養(yǎng)基以實罐滅菌為好，在升溫時先攪拌均勻，加入一定量的a-淀粉酶進行液化，并將原料大顆粒篩去。2、實罐滅菌時未充分排除罐內(nèi)空氣此種情況造成“假壓”使罐頂局部溫度達不到滅菌要求，導(dǎo)致滅菌不徹底而污染。防止措施：在實罐滅菌升溫時，應(yīng)打開排氣閥門有關(guān)相連接管的邊閥、壓力表接管邊閥等，達到徹底滅菌。3、培養(yǎng)基連續(xù)滅菌時蒸汽壓力波動大蒸汽壓力波動大，使培養(yǎng)基未達到滅菌溫度，導(dǎo)致滅菌不徹底而受污染。防止措施：培養(yǎng)基連續(xù)滅菌時應(yīng)嚴格控制滅菌溫度，最好采用自動控制裝置。（五）操作問題操作不當引起雜菌污染：如移種時或發(fā)酵過程，罐內(nèi)壓力跌零，使外界空氣進入而染菌；泡沫頂蓋而造成污染；壓縮空氣壓力突然下降，使發(fā)酵液倒流入空氣過濾器而造成污染等等。防止措施：科學(xué)管理，加強技術(shù)培訓(xùn)和責任心教育等。二、染菌隱患的處理01嚴格按操作工藝進行02投產(chǎn)前進行整個發(fā)酵系統(tǒng)的無菌測試03加強在線檢測技術(shù)04定期對設(shè)備維修05嚴格工人的管理三、染菌后處理措施1、染菌培養(yǎng)基須滅菌才可排入下水道否則由于各罐的管道相通，會造成其它罐的染菌，而且直接放下水道也會造成空氣的污染而導(dǎo)致其它罐批染菌。滅菌方法：可通蒸汽滅菌，也可加入過氧乙酸等化學(xué)滅菌劑攪拌半小時，才放下水道。2、尋找染菌的原因?qū)ΠY下藥，染菌罐徹底清洗，進行空罐消毒。3、車間環(huán)境消毒染菌厲害時，車間環(huán)境要用石灰消毒，空氣用甲醛熏蒸。若污染噬菌體，空氣必須用甲醛蒸汽消毒。三、染菌后處理措施小結(jié)1、染菌的原因：設(shè)備滲漏、空氣帶菌、種子帶菌、滅菌不徹底、操作不當。2、染菌后處理措施：發(fā)酵液必須滅菌后才可放下水道、尋找染菌的原因、染菌厲害時，車間環(huán)境要用石灰消毒。思考題1.有哪些原因會引起染菌？2.染菌以后應(yīng)采取什么措施？3.分析題：某發(fā)酵廠的第1號發(fā)酵罐生產(chǎn)時，連續(xù)多次發(fā)生染菌事件，且每次污染的雜菌種類基本相同，請分析這種情況下，染菌的原因可能是什么？染菌對發(fā)酵的影響發(fā)酵過程控制發(fā)酵的類型發(fā)酵染菌及處理菌種選育成品滅菌培養(yǎng)基的優(yōu)化種子培養(yǎng)發(fā)酵生產(chǎn)產(chǎn)物分離純化什么叫發(fā)酵染菌?在發(fā)酵過程中，生產(chǎn)菌以外的其他微生物侵入了發(fā)酵液，從而使發(fā)酵過程失去了真正意義上的純種培養(yǎng)。01染菌對不同發(fā)酵工藝的影響02雜菌種類不同對發(fā)酵的影響03不同污染原因?qū)Πl(fā)酵的影響04不同污染時間對發(fā)酵的影響05染菌程度對發(fā)酵的影響06染菌對產(chǎn)物提取的影響菌種、培養(yǎng)基、發(fā)酵條件、發(fā)酵周期以及產(chǎn)物性質(zhì)等不同，染菌造成的危害程度也不同。一、染菌對不同發(fā)酵工藝的影響肌苷、肌苷酸發(fā)酵——生產(chǎn)菌是多種營養(yǎng)缺陷型，生長能力差，培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富等——易染菌谷氨酸發(fā)酵——周期短，生產(chǎn)菌繁殖快，加之培養(yǎng)基不太豐富——極少污染，但噬菌體危害大。檸檬酸發(fā)酵——產(chǎn)酸后pH值很低，一般雜菌不易生長——防止前期染菌?？傊瑹o論何種發(fā)酵，染菌后都會造成糖及其他營養(yǎng)基質(zhì)被消耗，而影響發(fā)酵產(chǎn)物的合成，使產(chǎn)量大大地降低。二、不同雜菌種類對發(fā)酵的影響在工業(yè)發(fā)酵中，不同種類的雜菌對發(fā)酵造成的危害是不同的。青霉素發(fā)酵：污染細短產(chǎn)氣桿菌比粗大桿菌的危害大鏈霉素發(fā)酵：污染細短桿菌、假單孢桿菌和產(chǎn)氣桿菌比粗大桿菌的危害大四環(huán)素發(fā)酵：污染雙球菌、芽孢桿菌和夾膜桿菌的危害較大檸檬酸發(fā)酵：最怕污染青霉菌肌苷、肌苷酸發(fā)酵：污染芽孢桿菌的危害最大谷氨酸發(fā)酵：最怕污染噬菌體、因為噬菌體蔓延迅速，難以防治，容易造成連續(xù)污染。高溫淀粉酶發(fā)酵：污染芽孢桿菌和噬菌體的危害較大02空氣帶菌使發(fā)酵大面積染菌03培養(yǎng)基或設(shè)備滅菌不徹底一般不具延續(xù)性，使單個（批）發(fā)酵罐發(fā)酵失敗04設(shè)備滲漏染菌幾率較大01種子帶菌將導(dǎo)致染菌范圍不斷擴大，使生產(chǎn)蒙受重大損失。三、不同染菌途徑對發(fā)酵的影響四、不同染菌時間對發(fā)酵的影響染菌時間：指無菌檢查方法確準的污染時間，不是雜菌進入培養(yǎng)液的時間0102040302發(fā)酵前期染菌雜菌與生產(chǎn)菌爭奪營養(yǎng)成分，干擾生產(chǎn)菌的繁殖和產(chǎn)物的形成03發(fā)酵中期染菌嚴重干擾生產(chǎn)菌的繁殖和產(chǎn)物的生成04發(fā)酵后期染菌如雜菌量不大，可繼續(xù)發(fā)酵。如污染嚴重，可采取措施提前放罐01種子培養(yǎng)期染菌菌體濃度低、培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，最易染菌，且危害最大五.不同染菌程度對發(fā)酵的影響染菌程度越大，對發(fā)酵的危害就愈大。當生產(chǎn)菌已迅速繁殖，在發(fā)酵液中占有優(yōu)勢，污染極少數(shù)雜菌(1~2個雜菌/1L)，對發(fā)酵不會造成影響，因為這些雜菌需要時間繁殖才能達到危害發(fā)酵的程度，而且環(huán)境對雜菌的繁殖已不利。但是污染幅度較大時，特別是發(fā)酵前期和中期污染，將造成嚴重的危害。六.染菌對產(chǎn)物提取和產(chǎn)品質(zhì)量的影響對過濾的影響：02發(fā)酵液粘加大，甚至發(fā)臭。01菌體大多自溶03由于發(fā)酵不徹底，基質(zhì)的殘留濃度增加六.染菌對產(chǎn)物提取和產(chǎn)品質(zhì)量的影響造成影響：大幅度降低過濾效率過濾時間延長，設(shè)備周轉(zhuǎn)率降低解決方法：加熱發(fā)酵液，加助濾劑或絮凝劑，凝聚蛋白六.染菌對產(chǎn)物提取和產(chǎn)品質(zhì)量的影響對提取的影響：有機溶劑萃取工藝：染菌的發(fā)酵液含有更多的水溶性蛋白，易發(fā)生乳化，使水相和溶劑相難于分開離子交換工藝：雜菌易粘附在離子交換樹脂表面或被離子交換樹脂吸附，大大降低離子交換樹脂的交換量沉淀法提?。弘s質(zhì)隨產(chǎn)物沉淀而影響下游處理工序，影響產(chǎn)品質(zhì)量六.染菌對產(chǎn)物提取和產(chǎn)品質(zhì)量的影響對產(chǎn)品質(zhì)量的影響：對內(nèi)在質(zhì)量：染菌的發(fā)酵液含有較多的蛋白質(zhì)和其它雜質(zhì)——產(chǎn)品純度對產(chǎn)品外觀：一些染菌發(fā)酵液經(jīng)過處理過濾后得到澄清的發(fā)酵液，放置后會出現(xiàn)渾濁，影響外觀小結(jié)1、染菌的概念2、染菌時間3、染菌對發(fā)酵影響的六個方面染菌異?，F(xiàn)象及處理方法

溶解氧的異常變化一、發(fā)酵過程中異?，F(xiàn)象判斷染菌ⅠⅣⅡⅢ正常的溶解氧曲線Ⅰ發(fā)酵初期，溶解氧基本不變Ⅱ?qū)?shù)生長期，溶解氧濃度迅速下降Ⅲ發(fā)酵中期，溶解氧有波動但變化不大Ⅳ發(fā)酵后期，溶解氧濃度上升異常的溶解氧曲線1、當感染噬菌體時，生產(chǎn)菌的呼吸作用受抑制，溶解氧濃度迅速上升。感染噬菌體時的溶解氧的變化比菌體濃度變化更靈敏。2、當受到非好氣性雜菌污染時，抑制生產(chǎn)菌的生長，降低溶解氧的消耗，使溶氧升高。3、污染好氣性雜菌時，溶解氧的變化是短時間內(nèi)下降，直至為零，且在較長時間內(nèi)不能回升案例

排氣中CO2異常變化顯示染菌好氧發(fā)酵排氣中CO2含量與糖代謝有關(guān)，發(fā)酵工藝一定時，排氣中CO2含量變化是有規(guī)律的。02污染雜菌，糖耗加快，CO2含量增加。03感染噬菌體，糖耗減慢，CO2含量減少。

其他異?，F(xiàn)象菌體生長不良pH值的異常變化泡沫的異常增多代謝異常發(fā)酵周期的延長發(fā)酵液的粘度異常發(fā)酵液顏色異常變化二、染菌的檢查檢查方法有哪些？革蘭氏染色鞭毛染色顯微鏡檢查法

肉湯培養(yǎng)法檢查培養(yǎng)基和無菌空氣是否帶菌或菌種中是否有噬菌體。常用葡萄糖酚紅肉湯作為培養(yǎng)基陽性陰性平板劃線培養(yǎng)或斜面培養(yǎng)檢查法1234倒平板空培養(yǎng)待測樣品劃線培養(yǎng)觀察總結(jié)以平板劃線和肉湯培養(yǎng)結(jié)果為主要根據(jù)肉湯連續(xù)發(fā)生三次變色反應(yīng)或產(chǎn)生混濁，或平板培養(yǎng)連續(xù)三次發(fā)現(xiàn)有異常菌落的出現(xiàn)，即可判斷為染菌。020103無菌試驗的肉湯或平板應(yīng)保存并觀察至本批放罐后12h，確認為無雜菌后才能棄去。要定期取樣，取樣時防止外界雜菌混入。無菌試驗期間應(yīng)及時觀察無菌試驗樣品，以便能及早發(fā)現(xiàn)染菌。注意事項種子培養(yǎng)期染菌的處理二、雜菌后處理方法種子罐染菌發(fā)酵罐×物料管道供氣管道徹底滅菌備用種子無重新制備種子有發(fā)酵前期染菌的處理發(fā)酵前期染菌的處理培養(yǎng)基中碳、氮含量高終止發(fā)酵，重新滅菌再接入種子進行發(fā)酵培養(yǎng)基中碳、氮消耗量多放掉部分料液，補入必要營養(yǎng)，重新滅菌再接種發(fā)酵降溫培養(yǎng)、調(diào)節(jié)ｐＨ、補加培養(yǎng)基發(fā)酵中后期染菌的處理發(fā)酵中后期染菌的處理輕微染菌適當加入殺菌劑或抗生素及正常的發(fā)酵液以抑制雜菌的生長速度。代謝產(chǎn)物已達一定水平明確是染菌可放罐或繼續(xù)培養(yǎng)加熱至1２0℃，保持30分鐘后排放無提取價值的發(fā)酵液案例：檸檬酸發(fā)酵中期染菌，處理措施：處理措施應(yīng)具體問題具體分析、多種方法綜合應(yīng)用，如污染細菌：加大通氣量，加速產(chǎn)酸，必要時加入鹽酸調(diào)節(jié)pH，抑制雜菌污染酵母：可加入0.025~0.