常見食品中微生物檢驗-糕點、糖果檢驗

糕點和糖果中大腸菌群的測定大腸菌群的概念◆大腸菌群(coliformbacteria)系指一群在37℃能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌?！舭òＯＪ暇鷮?、枸櫞酸桿菌屬、腸桿菌屬和克雷伯氏菌屬

測定意義

◆大腸菌群作為糞便污染指示菌。即在食品中檢出大腸菌群，不僅反映食品被糞便污染總的情況，一定程度上也反映了食品在生產(chǎn)加工、運輸、保存等過程中的衛(wèi)生狀況，具有廣泛的衛(wèi)生學(xué)意義?！舴彩谴竽c菌群數(shù)超過規(guī)定限量的食品，即可確定其衛(wèi)生學(xué)上是不合格的，該食品使用是不安全的。

大腸菌群數(shù)量的表示方法--MPN

MPN:MostProbableNumber(大腸菌群最可能數(shù))

◆

是采用一定的方法，應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)的原理所測定和計算出的一種最近似數(shù)值。

◆三管系列：對樣品進(jìn)行連續(xù)10倍梯度系列稀釋，選擇3個連續(xù)的合適的稀釋度，每個稀釋度接種3管到乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)培養(yǎng)，從規(guī)定的反應(yīng)呈陽性管數(shù)的出現(xiàn)率，查取大腸菌群最可能數(shù)(MPN)檢索表，報告每100mL(g)檢樣大腸菌群的最近似數(shù)。

大腸菌群MPN的檢驗方法--多管發(fā)酵法

大腸菌群的檢驗程序稀釋大腸菌群陰性革蘭氏陽性伊紅美藍(lán)瓊脂平板報告乳糖膽鹽發(fā)酵管革蘭氏陰性無芽孢檢樣產(chǎn)氣乳糖發(fā)酵管不產(chǎn)氣不產(chǎn)氣大腸菌群陰性大腸菌群陽性報告報告報告大腸菌群陰性革蘭氏染色產(chǎn)氣過程◆檢樣稀釋◆乳糖初發(fā)酵試驗（假定試驗）◆分離培養(yǎng)◆乳糖復(fù)發(fā)酵試驗（證實試驗）◆報告

檢樣稀釋

1.檢樣25mL(25g)放于含有225mL無菌生理鹽水的三角瓶內(nèi)，經(jīng)充分振搖作成1:10的均勻稀釋液。固體檢樣用無菌均質(zhì)器。以8000-10000r/min的速度處理1min，做成1:10的均勻稀釋液；檢樣稀釋2.用1mL無菌吸管吸取1:10稀釋液1mL，注入含有9mL無菌生理鹽水的試管內(nèi)，振蕩混勻，作1:100的稀釋液；3.另取1mL無菌吸管，按上述操作依次作10倍遞增稀釋液，每稀釋一次換用1支1mL無菌吸管；

檢樣稀釋4.根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)z樣污染情況估計，選3個稀釋度，每稀釋度接種3管。

每100mL消毒乳中大腸菌群MPN不超過40個

乳糖初發(fā)酵試驗◆目的：檢查樣品中有無發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的細(xì)菌?！魧⒋龣z樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi);◆乳糖：選擇作用，大腸菌群能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣;◆膽鹽：抑制其它雜菌，特別是革蘭氏陽性菌；◆溴甲酚紫：pH指示劑，細(xì)菌產(chǎn)酸后，培養(yǎng)基即由原來的紫色變?yōu)辄S色，溴甲酚紫還有抑制其他細(xì)菌如芽孢桿菌生長的作用。

◆接種量在1mL以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管；1mL及1mL以下者，用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管；◆每一稀釋度接種3管，置(36±1)℃溫箱內(nèi)，培養(yǎng)(24±2)h，如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管均不產(chǎn)氣，則可報告為大腸菌群陰性。◆如產(chǎn)氣，按另外程序進(jìn)行。

乳糖初發(fā)酵試驗大腸菌群陽性反應(yīng)乳糖膽鹽發(fā)酵管產(chǎn)酸產(chǎn)氣現(xiàn)象

分離培養(yǎng)◆將產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管培養(yǎng)物分別劃線接種到伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置(36±1)℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)18-24h，挑取典型的菌落，并作革蘭氏染色鏡檢和復(fù)發(fā)酵試驗。

分離培養(yǎng)◆伊紅美藍(lán)瓊脂平板（EMB）：伊紅和美藍(lán)染料作為指示劑，大腸菌群發(fā)酵乳糖造成酸性環(huán)境時，這兩種染料結(jié)合成復(fù)合物，使大腸菌群產(chǎn)生特征性菌落：◆a深紫黑色，有金屬光澤；◆b紫黑色、不帶或略帶金屬光澤；◆c淡紫紅色、中心顏色較深。伊紅美藍(lán)瓊脂平板特征性菌落

乳糖復(fù)發(fā)酵試驗（證實試驗）◆目的：證明從乳糖初發(fā)酵試驗呈陽性反應(yīng)的試管內(nèi)分離到的革蘭氏陰性無芽孢桿菌，確能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣。乳糖復(fù)發(fā)酵試驗（證實試驗）◆在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，挑取可疑大腸菌群菌落1-3個進(jìn)行革蘭氏染色。同時接種乳糖發(fā)酵管，置(36±1)℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)(24±2)h，觀察產(chǎn)氣情況。乳糖復(fù)發(fā)酵試驗（證實試驗）◆作用機理同乳糖初發(fā)酵試驗◆凡乳糖發(fā)酵管產(chǎn)酸產(chǎn)氣、革蘭氏染色陰性無芽胞桿菌，即報告為大腸菌群陽性；◆凡乳糖發(fā)酵管不產(chǎn)氣或革蘭氏染色陽性，即報告為大腸菌群陰性?！舾鶕?jù)證實為大腸菌群陽性的管數(shù)，查MPN的檢索表，報告每100mL(g)食品中大腸菌群的最可能數(shù)(MPN)。大腸菌群最可能數(shù)(MPN)檢索表陽性管數(shù)MPN個/100mL(g)陽性管數(shù)MPN個/100mL(g)1mL(g)×30.1mL(g)×30.01mL(g)×31mL(g)×30.1mL(g)×30.01mL(g)×3000<30100400013010170002601021100039010315001030110700116011111001290112150013120113190020601201100219012115002212012220002315012324003090130160031130131200032160132240033190133290大腸菌群最可能數(shù)(MPN)檢索表（續(xù)）陽性管數(shù)MPN個/100mL(g)陽性管數(shù)MPN個/100mL(g)1mL(g)×30.1mL(g)×30.01mL(g)×31mL(g)×30.1mL(g)×30.01mL(g)×32009030023020114030139020220030264020326030395021015031043021120031175021227031212002133403131600220210320930221280321150022235032221002234203232900230290330240023136033146002324403321100023353033324000說明◆本表采用3個稀釋度：1mL(g)、0.1mL(g)0.01mL(g)，每稀釋度3管；◆表內(nèi)所列檢樣量如改用10mL(g)、1mL(g)、0.1mL(g)，表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低10倍；◆如改用0.1mL(g)、0.01mL(g)0.001mL(g)，表內(nèi)數(shù)字相應(yīng)增加10倍；◆依此類推。糕點和糖果中菌落總數(shù)的測定相關(guān)概念1菌落總數(shù)測定的意義2菌落總數(shù)的測定3一、相關(guān)概念菌落：細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上生長繁殖而形成的能被肉眼識別的生長物，它由數(shù)以萬計相同的細(xì)菌集合而成。1、菌落總數(shù)：是指食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件（如培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間等）下培養(yǎng)后，所得1g或1ml檢樣中所細(xì)菌菌落的總數(shù)。常用菌落形成單位（CFU，colony－formingunits）表示。能在營養(yǎng)瓊脂上發(fā)育的嗜中溫性需氧菌需氧普通瓊脂平板37℃48h雜菌數(shù)、需氧菌數(shù)2、細(xì)菌總數(shù)：指一定或面積的食品樣品，經(jīng)過適當(dāng)處理后，在顯微鏡下對細(xì)菌進(jìn)行直接計數(shù)。其中包括各種活菌數(shù)和尚未消失的死菌數(shù)。也稱細(xì)菌直接鏡數(shù)。通常以1g、1mL或1cm2被檢樣品中的細(xì)菌總數(shù)來表示。二、菌落總數(shù)測定的意義1、判斷食品被污染程度的標(biāo)志2、預(yù)測食品保存期限三、菌落總數(shù)的測定食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定GB4789.2-2010（一）范圍（二）原理（三）主要設(shè)備（四）常規(guī)器皿與數(shù)量（五）培養(yǎng)基和試劑（六）檢驗程序（七）操作步驟（八）說明及注意事項（九）結(jié)果與報告三、菌落總數(shù)的測定食品菌落總數(shù)的測定菌落總數(shù)的測定高壓蒸汽滅菌鍋恒溫培養(yǎng)箱冰箱放大鏡或菌落計數(shù)儀恒溫水浴箱均質(zhì)機天平（感量0.1g）（三）主要設(shè)備（四）常規(guī)器皿與數(shù)量培養(yǎng)皿（直徑9cm）：8個10mL無菌刻度吸管：2根1mL無菌刻度吸管：若干根250mL三角燒瓶（內(nèi)置225mL生理鹽水或磷酸鹽緩沖液，幾粒玻璃珠，并事先滅菌）：1個18×180cm無菌試管（內(nèi)置9mL生理鹽水或磷酸鹽緩沖液，并事先滅菌）：若干玻璃珠；滅菌刀；剪刀；鑷子；酒精燈等平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基；75%乙醇；無菌生理鹽水或無菌磷酸鹽緩沖液（五）培養(yǎng)基和試劑（六）檢驗程序1、檢驗前準(zhǔn)備（1）培養(yǎng)基、無菌器材、無菌室、超凈工作臺等準(zhǔn)備（2）用酒精棉球消毒手和實驗臺，點燃酒精燈（3）打開錐形瓶、試管及培養(yǎng)皿外包扎的紙（4）在錐形瓶、試管、培養(yǎng)皿標(biāo)注即將盛放的稀釋液稀釋倍數(shù)（5）合理放置器皿：培養(yǎng)皿按稀釋倍數(shù)由低到高，從上往下放置（最上面放空白皿）（6）取一支1mL無菌移液管，以無菌方式打開，以無菌操作吸取1mL生理鹽水放入“空白”培養(yǎng)皿，做兩個平行，該移液管放置于廢物筐中。（七）操作步驟2、檢樣稀釋與加樣邊稀釋邊加樣3、傾注平板及時將15~20mL冷卻至46℃無菌瓊脂培養(yǎng)基溶液（可放置于46℃±1℃恒溫水浴箱中保溫）傾注入培養(yǎng)皿內(nèi)，并振動平皿，使其混合均勻。4、培養(yǎng)待瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，置于（36±1）℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)（48±2）h。水產(chǎn)品（30±1）℃培養(yǎng)（72±3）h。如果樣品中可能含有在瓊脂培養(yǎng)基表面彌漫生長的菌落時，可在凝固后的瓊脂表面覆蓋一薄層瓊脂培養(yǎng)基（約4mL），凝固后翻轉(zhuǎn)平板，按以上條件進(jìn)行培養(yǎng)。5、菌落計數(shù)準(zhǔn)備檢樣稀釋加樣培養(yǎng)計數(shù)（八）操作說明及注意事項1、檢驗中所用玻璃器皿在滅菌前徹底洗凈并完全滅菌。既不能存在活菌，也不能殘留抑菌物質(zhì)2、采樣時應(yīng)注意代表性，如系固體樣品，取樣后不應(yīng)集中在一點，宜多采幾個部位。3、每批稀釋的檢樣都要有空白對照。（1）實驗所使用的器皿滅菌是否徹底，儲存是否合理得當(dāng)。（2）無菌室的空氣條件是否達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。（3）操作人員的無菌操作技術(shù)是否規(guī)范。4、樣品稀釋液多用生理鹽水，有時也用磷酸緩沖液或0.1%的蛋白胨水。若檢樣含鹽量較高（如醬制品），也可用無菌蒸餾水。5、在連續(xù)遞次稀釋時，為減少樣品在稀釋時造成的誤差，每個稀釋液應(yīng)充分振蕩或換用另一支滅菌吸管充分吹打，使其均勻。6、一支滅菌吸管只能接觸一個倍數(shù)的稀釋液。也即每變化一個稀釋倍數(shù)時，更換一支滅菌吸管。吸管不得觸及燒瓶和試管的外側(cè)。連續(xù)稀釋放液時，應(yīng)使吸管內(nèi)的液體沿管壁注入，勿使吸取稀釋液的吸管尖端伸入稀釋液內(nèi)。7、瓊脂含量選為1.5%。營養(yǎng)瓊脂底部帶沉淀的部分應(yīng)棄去（以免與菌落混淆）。8、滅菌后，培養(yǎng)基應(yīng)冷卻到45℃后應(yīng)及時進(jìn)行倒平板操作，如果不能及時操作，需要將培養(yǎng)基放到45℃左右的恒溫水浴箱中保溫，以防止瓊脂凝固（用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進(jìn)行倒平板了）9、檢液加入平皿后20min內(nèi)傾入培養(yǎng)基并充分混勻，可將平皿先向一個方向旋轉(zhuǎn)，然后再向相反方向旋轉(zhuǎn)。旋轉(zhuǎn)要適度，培養(yǎng)基不可在旋轉(zhuǎn)中漏出或污染皿蓋。10、皿內(nèi)瓊脂凝固后即要將平皿翻轉(zhuǎn)后培養(yǎng)，這樣可避免菌落蔓延生長。倒置培養(yǎng)原因：（1）平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，將平板倒置，可以防止皿蓋上的水珠滴落，打散菌落，在培養(yǎng)基表面形成菌落蔓延，產(chǎn)生菌苔。（2）保濕：倒置培養(yǎng)比正常放置培養(yǎng)，培養(yǎng)基不容易干。（3）容易手拿，不易造成污染。（4）由于重力作用，菌會向下生長，菌落形成比較大。11、不同稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)與稀釋倍數(shù)成反比。若出現(xiàn)相反的情況，視為差錯。12、當(dāng)平板上有鏈狀菌落生長時，若鏈狀菌落之間無明顯界限，則計為一個菌落；若存在幾條不同來源的鏈，則每條鏈計為一個菌落；若平皿有較大片菌落生長時，則不宜采用；若片狀菌落平到平皿的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，則可計算半個平皿后乘以2，以代表全皿菌落數(shù)。（九）結(jié)果與報告1、菌落總數(shù)的計算方法2、菌落總數(shù)的報告方式例次不同稀釋度平均菌落數(shù)菌落總數(shù)/[CFU/mL(g)]報告方式/[CFU/mL(g)]10－110－210－311365164201640016000或1.6×10422760295463100031000或3.1×104328633629002900或2.9×1034不可計4650513513000510000或5.1×105527115270270或2.7×1026000<1×10<107不可計305123050031000或3.1×104計算（一）菌落總數(shù)如下面幾種情況，如何報告？例次不同稀釋度平均菌落數(shù)菌落總數(shù)/[CFU/mL(g)]報告方式/[CFU/mL(g)]10－110－210－31142013861631551810227752853286294465232952733343624不可計不可計49214873500522529258100060000007不可計不可計302314128菌落總數(shù)如下面幾種情況，如何報告？例次10-110-210-3空白127932248653563620200524400031420138616315518104糕點和糖果中常見產(chǎn)毒霉菌的分離與鑒定產(chǎn)毒霉菌極易在含糖的餅干、面包、糧食等類食品上生長，與食品衛(wèi)生關(guān)系密切的霉菌大部分屬于半知菌亞門中的曲霉屬、青霉屬和鐮刀菌屬。其產(chǎn)生的毒素主要有黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、雜色曲霉素、煙曲霉毒素、單端孢霉烯化合物、玉米赤霉烯酮、伏馬菌素以及展青霉素、桔青霉素、黃綠青霉素等。

曲霉屬：黃曲霉、赭曲霉、雜色曲霉、煙曲霉、構(gòu)巢曲霉和寄生曲霉等；

青霉屬：島青霉、桔青霉、黃綠青霉、擴張青霉、圓弧青霉、皺折青霉和蕁麻青霉等；

鐮刀菌屬：犁孢鐮刀菌、擬枝孢鐮刀菌、三線鐮刀菌、雪腐鐮刀菌、粉紅鐮刀菌、禾谷鐮刀菌等；

其它菌屬：有綠色木霉、漆斑菌屬、黑色葡萄狀穗霉等。

曲霉屬本屬的產(chǎn)毒霉菌主要包括黃曲霉、寄生曲霉、雜色曲霉、構(gòu)巢曲霉和棕曲霉。這些霉菌的代謝產(chǎn)物為黃曲霉毒素、雜色曲霉素和棕曲霉毒素。1、營養(yǎng)菌絲體由具橫隔的分枝菌絲構(gòu)成；無色或有明亮的顏色,一部分埋伏型,一部分氣生型。2、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)分生孢子梗大都無橫隔,光滑、粗糙或有麻點。梗的頂端膨大形成棍棒形、橢圓形、半球形或球形的頂囊,在頂囊上生出一層或二層小梗,雙層時下面一層為梗基,每個?；显僦鷥蓚€或幾個小梗。從每個小梗的頂端相繼生出一串分生孢子；由頂囊、小梗以及分生孢子鏈構(gòu)成一個頭狀體的結(jié)構(gòu),稱為分生孢子頭。分生孢子頭有各種不同顏色和形狀,如球形、放射形、棍棒形或直柱形等。曲霉屬黃曲霉構(gòu)巢曲霉黃曲霉黃曲霉黑曲霉煙曲霉青霉屬

本屬產(chǎn)毒霉菌,主要包括黃綠青霉、桔青霉、圓弧青霉、展開青霉、純綠青霉、紅青霉、產(chǎn)紫青霉、冰島青霉和皺褶青霉等。這些霉菌的代謝產(chǎn)物為黃綠青霉素、桔青霉素、圓弧偶氮酸、展青霉素、紅青霉素、黃天精、環(huán)氯素和皺褶青霉素。

1、營養(yǎng)菌絲體呈無色、淡色或鮮明的顏色,具橫隔,或為埋伏型或部分埋伏型部分氣生型。氣生菌絲密氈狀、松絮狀或部分結(jié)成菌絲索。2、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)

分生孢子梗由埋伏型或氣生型菌絲生出,稍垂直于該菌絲(除個別種外,不象曲霉那樣生有足細(xì)胞),單獨直立或作某種程度的集合及至密集為一定的菌絲束,具橫隔,光滑或粗糙。其先端生有掃帚狀的分枝輪,稱為帚狀枝。帚狀枝是由單輪或兩次到多次分枝系統(tǒng)構(gòu)成,對稱或不對稱,最后一級分枝即產(chǎn)生孢子的細(xì)胞,稱為小梗。青霉菌鐮刀菌屬

本屬的產(chǎn)毒霉菌主要包括禾谷鐮刀菌、串珠鐮刀菌、雪腐鐮刀菌、三線鐮刀菌、梨孢鐮刀菌、擬枝孢鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、茄病鐮刀菌和木賊鐮刀菌等。這些霉菌的代謝產(chǎn)物為單端孢霉烯族化合物、玉米赤霉烯酮和丁烯酸內(nèi)酯等。

1、營養(yǎng)菌絲體

氣生菌絲發(fā)達(dá)高0.5～1.0cm或較低為0.3～0.5cm，或更低為0.1～0.2cm；稀疏的氣生菌絲，甚至完全無氣生菌絲而由基質(zhì)菌絲直接生出黏孢層，內(nèi)含大量的分生孢子。

2、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)可產(chǎn)生大、小兩種分生孢子。小型分生孢子通常假頭狀著生,較少為鏈狀著生,或者假頭狀和鏈狀著生兼有。小型分生孢子生于分枝或不分枝的分生子梗上,形狀多樣,卵形、梨形、橢圓形、長橢圓形、紡錘形、披針形、臘腸形、柱形、錐形、逗點形、圓形等。1～2(3)隔,通常小型分生孢子的量較大型分生孢子為多。大型分生孢子產(chǎn)生在菌絲的短小爪狀突起上或產(chǎn)生在分生孢子座上,或產(chǎn)生在粘孢團(tuán)中;大型分生孢子形態(tài)多樣,鐮刀形、線形、紡錘形、披針形、柱形、臘腸形、蠕蟲形、鰻魚形,彎曲、直或近于直。頂端細(xì)胞多種形態(tài),短啄形、錐形、鉤形、線形、柱形,逐漸變窄細(xì)或突然收縮。鐮刀菌鏈格孢霉菌瓶霉菌（一）產(chǎn)毒霉菌的分離按GB/T4789.15-2003方法進(jìn)行分離方法一稀釋平板法1、檢樣的前處理及梯度稀釋25g檢樣放入研缽磨碎（可先加少量無菌生理鹽水）2、取10-1、10-2、10-3三個稀釋度涂布平板，靜置5min后倒置于溫箱28-30℃培養(yǎng)3-5天。方法二點種法1.采樣在衛(wèi)生學(xué)調(diào)查基礎(chǔ)上，采取有代表性的樣品250～500g，盡快檢驗。2.表面除菌

如為糕點樣品，取糕點樣品10～20g，放人滅菌的150ml三角瓶中，無菌加入無菌水超過樣面1～2cm左右，塞好塞子充分振搖