基因工程制藥-基因工程制藥實(shí)例

基因工程制藥實(shí)例一、干擾素的介紹組成：是一組具有多種功能的活性蛋白質(zhì)（主要是糖蛋白），根據(jù)結(jié)構(gòu)可分為α、β、γ、ω等四種類型。作用：是一種廣譜抗病毒劑，具有抗病毒、抑制細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)免疫及抗腫瘤作用。特點(diǎn)：具有高度的種屬特異性。二、干擾素的生產(chǎn)方法1、血液制取產(chǎn)量極低、價(jià)格昂貴，無法普及推廣。2、基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)利用重組大腸桿菌進(jìn)行發(fā)酵，實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。三、干擾素發(fā)酵工藝過程1、菌種制備取零下70℃下保存的甘油管菌種，接種于搖瓶，培養(yǎng)溫度30℃，pH值7.0，250rpm活化培養(yǎng)18±2h后，進(jìn)行吸光值測定和雜菌檢查。2、種子罐培養(yǎng)將活化菌種接入種子罐，接種量10%，培養(yǎng)溫度30℃，pH值7.0，調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速，控制溶解氧為30%，培養(yǎng)3-4小時(shí)，當(dāng)OD值達(dá)到4.0以上時(shí)，轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐，進(jìn)行二級(jí)放大培養(yǎng)，同時(shí)注意雜菌檢查。3、發(fā)酵罐培養(yǎng)將種子液接入發(fā)酵罐中，接種量10%，培養(yǎng)溫度30℃，pH值7.0。調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速，控制溶解氧為30%，培養(yǎng)4h。然后控制培養(yǎng)溫度20℃，pH值6.0，溶解氧為60%，繼續(xù)培養(yǎng)5~6.5h，當(dāng)菌體OD值達(dá)到9.0±1.0后，用冷水快速降溫至15度以下，以減緩細(xì)胞衰老，或者將發(fā)酵液轉(zhuǎn)入收集罐，加入冰塊，使溫度迅速將至10℃以下。4、菌體收集將已降溫至20℃以下的發(fā)酵液轉(zhuǎn)入離心機(jī)，1600r/min離心收集。進(jìn)行干擾素含量、菌體蛋白含量、菌體干燥、質(zhì)粒結(jié)構(gòu)一致性、質(zhì)粒穩(wěn)定性等項(xiàng)目的檢測。菌體于-20℃保存時(shí)不能超過12個(gè)月，每保存13個(gè)月，檢查一次活性。四、干擾素分離純化工藝1、菌體裂解用純化水配置裂解緩沖液，降溫至2~10℃。將-20℃雷動(dòng)的菌體破碎，加入裂解緩沖液（pH7.0）中，2-10℃攪拌2h，利用冷凍復(fù)融分散，將細(xì)胞完全破碎，釋放干擾素蛋白。2、沉淀向裂解液中加入聚乙烯亞胺。2~10℃下氣動(dòng)攪拌45min，對(duì)菌體碎片進(jìn)行絮凝。然后向裂解液中加入醋酸鈣溶液，2~10℃下氣動(dòng)攪拌15min，對(duì)菌體碎片、DNA等進(jìn)行沉淀。3、離心在2~10℃下，將懸浮液在連續(xù)流離心機(jī)上于16000r/min離心。收集含有目標(biāo)蛋白的上清液，細(xì)胞壁等雜質(zhì)沉淀在121℃蒸汽30min后焚燒處理。4、鹽析將收集的上清液用4mol/l硫酸銨進(jìn)行鹽析，2~10℃攪拌靜置過夜。5、離心與儲(chǔ)存將鹽析液在連續(xù)流離心機(jī)上于16000r/min離心，沉淀即為粗干擾素，放入聚乙烯瓶中，于4℃冰箱保存，不能超過3個(gè)月。滅菌滅菌配置培養(yǎng)基離心與儲(chǔ)存離心鹽析生產(chǎn)菌接種菌種活化種子培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)