黃酒麥曲發(fā)酵過程中真菌的分布

黃酒麥曲發(fā)酵過程中真菌的分布

“小麥酒”是中國黃酒的特點(diǎn)。在黃酒生產(chǎn)中，小麥卷的用量約占原料大米的1.6%。小麥卷是黃酒工業(yè)的傳統(tǒng)技術(shù)，生產(chǎn)有明顯的季節(jié)性。一般選擇農(nóng)歷7~8月,以當(dāng)年新收小麥和水為原料,在開放式培養(yǎng)環(huán)境中,網(wǎng)羅自然環(huán)境中的微生物群落,借助于原料中的營養(yǎng),通過發(fā)酵過程中溫濕度的控制,實(shí)現(xiàn)有益微生物群落的生長和代謝。麥曲的發(fā)酵工藝流程為:生小麥→過篩→軋碎→加水拌曲→成型→曲房堆曲發(fā)酵→保溫培養(yǎng)→通風(fēng)干燥→成品麥曲。經(jīng)過天然固態(tài)發(fā)酵所形成的麥曲既是黃酒濃醪發(fā)酵的物質(zhì)基礎(chǔ),也是奠定黃酒風(fēng)格的重要保障。當(dāng)前隨著黃酒生產(chǎn)規(guī)模的快速拓展,麥曲的季節(jié)性發(fā)酵日益成為發(fā)展的瓶頸,能否實(shí)現(xiàn)全年常規(guī)化生產(chǎn)不僅需要嘗試,更需要對影響麥曲中微生物群落的成因開展研究。由于在麥曲的天然發(fā)酵過程中,來源于小麥原料自身、制曲工具攜帶和空氣中的微生物,都可以參與或影響發(fā)酵過程,對于其中的微生物影響尚未見報道,而在與之類似的白酒大曲已經(jīng)開展了較多的研究。針對麥曲通常被認(rèn)為是典型的霉菌曲,作者對黃酒麥曲發(fā)酵中各個可能的影響因素進(jìn)行了研究,包括真菌分布以及結(jié)合發(fā)酵過程中曲坯真菌群落的變化來探討麥曲發(fā)酵的真菌成因。1材料和方法1.1材料表面1.1.1除草和鋪漿采集紹興某黃酒廠麥曲發(fā)酵所用的小麥原料、拌料用水及輔助工具,包括覆蓋用的稻草和鋪灑在發(fā)酵車間地面的谷殼。采用真空泵抽濾的方式分別采集連續(xù)6d的麥曲發(fā)酵車間、加水拌曲成型車間、黃酒廠廠區(qū)的空氣樣本,收集于無菌濾膜上,保存在7mL無菌離心管中。所有樣品于4℃冰箱保存并及時分離。1.1.2培養(yǎng)基1mgso47h2oNaNO32g/L,K2HPO41g/L,KCl0.5g/L,MgSO4·7H2O0.5g/L,FeSO4·7H2O0.01g/L,蔗糖30g/L。用于樣品中真菌的分離培養(yǎng),分別加入30U/mL的鏈霉素和300mg/L的去氧膽酸鈉,用于抑制細(xì)菌的生長和菌絲的蔓延。2土壤前性培養(yǎng)基馬鈴薯200g/L,葡萄糖20g/L,用于保藏分離獲得的純種。1.2方法1.2.1稀釋和加強(qiáng)整理對采集的小麥和稻草、谷殼按四分法取樣10g,用無菌水制成10%的浸提液,振蕩洗滌;收集于0.25μm無菌濾膜上的空氣樣本和經(jīng)過膜過濾截留的水樣,用無菌水振蕩洗滌含濾膜的離心管,適當(dāng)稀釋。取不同稀釋度的稀釋液200μL均勻涂布于含查氏培養(yǎng)基的平板中,每個樣品平行涂布3塊。平板倒置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3~5d,根據(jù)菌落形態(tài)和顏色的不同進(jìn)行挑菌,分離純化得到純種,分離純種保存于土豆斜面中。1.2.2苯酚-氯-pcr法對分離得到的純種真菌菌絲體富集后,采用氯化芐法提取真菌DNA。在7mL離心管中依次加入1mL提取液,1.8mL10%SDS,2mL氯化芐,混合均勻,在50℃水浴中放置1h,每隔15min顛倒搖晃一次。加入1.5mL30%NaAc,在冰浴中放置15min,10000r/min離心15min,吸取上清液于另一離心管中,加入0.6倍體積的預(yù)冷的異丙醇,0.1倍體積的0.3mol/LNaAc,混合在-20℃冰箱中保存過夜。10000r/min下離心10min,棄去上清液,加200μLTE溶解沉淀,加100μL苯酚和100μL氯仿抽提,混合均勻,在12000r/min下離心5min,取上清液于另一1.5mL離心管中,苯酚-氯仿抽提2次。加入與上清液等體積的異戊醇,12000r/min下離心5min,取上清液于另一個1.5mL的離心管中,加入3倍體積的無水乙醇,冰浴中放置30min,12000r/min離心2min,棄去上清液,用100μL70%乙醇洗滌沉淀,16000r/min下離心2min,棄去上清液,倒置至干,加40μLTE于-20℃中放置。1.2.3pcr引物及其制備PCR擴(kuò)增采用真菌通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系為50μL。其中39.5μL水,5μLMg2+(1.5mmol/L),1μLdNTP(200μmol/L),引物ITS1和ITS4各1μL(0.5μmol/L),2μLDNA模板,0.5μLTaq酶(2.5U)。94℃5min,(94℃1min,52℃1min,72℃1min)30個循環(huán),72℃10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.8g/dL的瓊脂糖凝膠中電泳,每塊膠中加入1μLgoldviewer,1μLlodingbuffer,5μLPCR產(chǎn)物。1.2.4a生物工程技術(shù)有限公司為生物計(jì)算公件,2.PCR產(chǎn)物經(jīng)PCR快速純化試劑盒(上海博彩生物科技有限公司產(chǎn)品)純化后,由上海生工生物工程技術(shù)有限公司測序。測序結(jié)果提交GenBank數(shù)據(jù)庫,利用Blastn軟件進(jìn)行序列比對,獲得與所得序列相似性程度最高的菌株。2結(jié)果與討論2.1小麥微生物污染的現(xiàn)狀黃酒麥曲固態(tài)天然發(fā)酵中的原料小麥為當(dāng)年新收小麥,經(jīng)過篩軋碎,加入20%~22%清水拌勻,在曲模中壓成型。對小麥和拌料用水中的真菌進(jìn)行分離培養(yǎng),其中原料小麥中真菌的含量高達(dá)106~107/g小麥,拌料水中真菌含量為10~100mL。對純株進(jìn)行ITS序列分析,結(jié)果見表1。分離培養(yǎng)的結(jié)果顯示,麥曲發(fā)酵的原料小麥中不僅真菌含量高,而且包含的真菌種類也較多,包括了曲霉(Aspergillus)、犁頭霉(Absidia)、青霉(Penicillium)、毛霉(Mucor)和鎖擲孢酵母(Sporidiobolus)。相比而言,拌料用水是符合飲用水標(biāo)準(zhǔn)的清水,其中的真菌含量低,且種類基本都存在于小麥原料中。結(jié)合料水比來看,拌料壓型的曲坯中真菌基本都來源于小麥籽粒中存在的真菌。目前已有的糧食微生物調(diào)查研究結(jié)果顯示,新收小麥的表面和內(nèi)部都含有大量的微生物,尤其是絲狀真菌的數(shù)量很高,籽粒內(nèi)外真菌數(shù)量級為103~105/g,種類極具多樣性,包括田間微生物(以鏈格孢霉、芽枝霉、鐮孢霉為主要種類)和貯藏微生物(以曲霉、青霉為主要種類)。微生物的含量和種類與不同產(chǎn)地和品種有關(guān),長江流域及平原地區(qū)的帶菌量遠(yuǎn)高于丘陵山地,且小麥微生物的污染呈現(xiàn)逐年增高趨勢。黃酒廠每年從各地收購的新小麥袋裝堆放在原料車間,通?？蛇_(dá)2至數(shù)月。由于小麥本身的營養(yǎng)、含水量,加上適宜的溫度,存在于小麥籽粒中的真菌會有一個緩慢生長的過程,導(dǎo)致原料中的含菌量很高。2.2對抗菌性能的分離在麥曲發(fā)酵過程中,需要使用的輔助用具包括稻草和谷殼。將壓成型的曲坯側(cè)立成“丁”字型疊放,預(yù)先在打掃干凈的發(fā)酵車間地面上鋪上谷殼,曲坯上面覆蓋上稻草簾保溫,3~5d后取掉保溫簾。對這兩類輔助用具上的真菌進(jìn)行分離培養(yǎng),結(jié)果見表2。分離結(jié)果表明,兩類輔助用具上真菌的單位含量基本與小麥中的含量接近,且所含真菌的種類非常豐富。除了原料小麥中所含有的真菌外,還含有黃曲霉(Aspergillusflavus)和青霉(Penicilliumvinaceum)。這兩類用具都具有保溫、保濕和透氣性,一般發(fā)酵車間地面鋪灑的谷殼為當(dāng)年新碾,而覆蓋保溫用的稻草簾則是反復(fù)使用的,只要不腐爛,往往是經(jīng)年沿用。2.3空氣溶膠中真菌的分離采集發(fā)酵車間、拌水成型車間、生產(chǎn)廠區(qū)空氣樣本,研究氣溶膠中真菌微生物的分布情況,結(jié)果見表3。霉菌孢子廣泛存在于空氣之中,從空氣樣本中共分離培養(yǎng)獲得17種真菌,其中米曲霉、構(gòu)巢曲霉、傘枝犁頭霉和鎖擲孢酵母在所有的空氣溶膠樣本中均可分離獲得。+:表示分離獲得真菌比較不同采集地點(diǎn)空氣溶膠中的真菌,可以看出其存在種類相差較大,其中發(fā)酵車間的空氣溶膠中分離出真菌種類多達(dá)13種,且有7種曲霉。分離培養(yǎng)的結(jié)果還表明,發(fā)酵車間的空氣溶膠中真菌的含量比其他兩個采集點(diǎn)高1~2個數(shù)量級。結(jié)合具體生產(chǎn)現(xiàn)場來看,由于麥曲拌水壓型車間空間小,溫度相對較高,而這一生產(chǎn)環(huán)節(jié)中工人的勞動強(qiáng)度較大,因而在車間內(nèi)使用大功率的風(fēng)扇降溫,以便適合工人作業(yè),所以拌水壓型車間內(nèi)空氣流通性相對較大。而發(fā)酵車間是一個相對密閉的環(huán)境,車間的面積巨大,空氣的流動性差,伴隨著大量麥曲的批次發(fā)酵,真菌孢子飛散到空氣溶膠中,導(dǎo)致車間內(nèi)空氣中真菌在數(shù)量和種類(尤其是曲霉的種類)豐富,孢子的沉降可能對于后續(xù)批次的發(fā)酵產(chǎn)生影響。2.4發(fā)酵過程中真菌的生長特性采集黃酒麥曲發(fā)酵過程中不同發(fā)酵時間下的曲坯,進(jìn)行真菌的分離培養(yǎng),根據(jù)菌落在察氏培養(yǎng)基上的形態(tài)和顏色不同,分別進(jìn)行挑菌并估算每種菌株在各樣品中的菌落數(shù),來估算黃酒麥曲樣品中每種真菌的相對含量。根據(jù)菌落大小、形態(tài)和顏色等表型特征進(jìn)行初步篩選和分離純化,共獲得10株純種菌株,其相對含量見表4。+,++,+++分別表示分離真菌出現(xiàn)的多少對上述10株分離自黃酒麥曲發(fā)酵過程中純種真菌進(jìn)行ITS-PCR擴(kuò)增及序列分析,通過BLAST搜索軟件在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對它們的最相似菌株,結(jié)果見表5。分析表4和表5結(jié)果,可以看出在黃酒麥曲的發(fā)酵過程中,存在的主要真菌種屬隨著發(fā)酵的進(jìn)行而發(fā)生有規(guī)律的變化。在發(fā)酵第1周中,Sporidioboluspararoseus(FH1)、米曲霉(Aspergillusoryzae,FH4)、微小根毛霉(Rhizomucorpusillus,FH7)發(fā)生明顯的生長過程,伴隨著發(fā)酵過程中品溫和水分含量的變化,見圖1。Sporidioboluspararoseus的生長終止于品溫達(dá)到50℃,水分含量低于18%的第4天;微小根毛霉則能在比較寬的品溫和水分含量范圍內(nèi)生長,而米曲霉在品溫最高的第3-4天,含量達(dá)到該階段的較高點(diǎn),此后仍保持一定的含量。比較有趣的是傘枝犁頭霉(Absidiacorymbifera,FH2),這種真菌直到發(fā)酵的第2天才開始出現(xiàn),隨后受制于高品溫的影響,隨著品溫的逐步降低而快速生長,到發(fā)酵一周時含量達(dá)到最大。在黃酒麥曲發(fā)酵的后兩周中,Sporidioboluspararoseus在第3周中又有一個生長過程,而米曲霉從第10天開始,生長繁殖非常迅猛。傘枝犁頭霉則始終存在于后兩周中,并在第3周有明顯的生長變化。在發(fā)酵后兩周中,值得注意的是構(gòu)巢曲霉(Emericellanidulans,FH5)出現(xiàn)明顯的數(shù)量變化,說明存在生長繁殖過程。2.5麥曲的發(fā)酵過程從麥曲生產(chǎn)原料、輔助用具及環(huán)境空氣溶膠中的真菌分布研究結(jié)果來看,米曲霉、傘枝犁頭霉、構(gòu)巢曲霉存在于所有樣品中,同時它們也是成品麥曲的主要真菌,并且在不同年度的成品麥曲中保持穩(wěn)定。在麥曲發(fā)酵生產(chǎn)中,軋碎后的小麥拌水后,在曲模中機(jī)械壓成型送入發(fā)酵車間,第1天傍晚覆蓋上稻草簾保溫保濕,關(guān)閉門窗,品溫上升到50~55℃以上,麥粒表面菌絲繁殖旺盛,水分大量蒸發(fā),及時取掉覆蓋物并適當(dāng)開啟門窗降溫通氣。一般發(fā)酵4~5d左右,曲坯表面開始變得堅(jiān)硬。結(jié)合麥曲的生產(chǎn)工藝和分離研究結(jié)果進(jìn)行分析,認(rèn)為雖然米曲霉存在于所有樣品中,但從數(shù)量級上可以推斷,出現(xiàn)在麥曲發(fā)酵早期的米曲霉主要是由軋碎的小麥籽粒帶入的。發(fā)酵第一周中的Sporidioboluspararoseus存在于小麥、谷殼和全部的空氣溶膠樣品中,起始生長多源于小麥。比較奇怪的是微小根毛霉未能從任何原料、環(huán)境樣品中分離獲得,分析可能是在菌落挑取中與其他形態(tài)類似的菌混淆而遺漏了。比較3個年度之間的成品麥曲,發(fā)現(xiàn)微小根毛霉的含量存在波動。而對于出現(xiàn)在發(fā)酵第2天的傘枝犁頭霉,雖然能從所有的樣品中都分離獲得,但由于其并未在發(fā)酵起始就出現(xiàn),而是在稻草覆蓋后才出現(xiàn),結(jié)合生產(chǎn)工藝推斷含菌量較高的輔助用具稻草可能是其主要來源。然而存在于所有樣品中的構(gòu)巢曲霉直到發(fā)酵第2周才出現(xiàn),比較難以解釋,推測可能涉及真菌之間的相互作用或是該菌的營養(yǎng)要求及生長特性有關(guān),但構(gòu)巢曲霉是成品麥曲中的穩(wěn)定的特征菌之一,對其可能來源尚需進(jìn)一步研究。3麥曲發(fā)酵過程中真菌群落的演變過程研究了小麥制曲生產(chǎn)中的原料小麥、拌料用水、輔助用具稻草和谷殼,及其廠區(qū)、壓型車間、發(fā)酵車間的空氣樣品中真菌的分布情況,涉及11個屬的真菌,它們是曲霉屬(裸胞殼屬)、青霉屬、犁頭霉屬、毛霉屬、畢赤酵