【地中海貧血分子診斷癥研究綜述6500字】

地中海貧血分子診斷癥研究綜述目錄TOC\o"1-2"\h\u11943地中海貧血分子診斷癥研究綜述 111329引言 1160551地貧的分子病理學機制 2234142地貧的篩查方法 2263713.1SouthernBlot分子雜交 3175173.2跨越斷裂點PCR技術 3316613.3多重PCR 3144313.4Real-TimePCR（實時熒光PCR）技術 4102774.1PCR反向斑點雜交 5163044.2基于引物延伸的檢測——微測序技術(minisequencing) 5315264.3基于實時PCR平臺的檢測 6241774.4無創(chuàng)產前診斷 7245045結語 721979identificationofnovel 9[摘要]地中海貧血（是一種最常見的常染色體隱性遺傳性血液病。其致病機制為珠蛋白基因發(fā)生缺陷引起珠蛋白鏈合成減少或缺如，使血紅蛋白的α-鏈/非α-鏈比例失衡，從而導致的一組溶血性疾病。該病目前尚無經濟有效的根治方法，通過人群分子篩查和基因診斷，對高風險夫婦孕期胎兒進行產前診斷而避免重型地貧患兒的出生，是國內外公認的首選預防措施。因此，準確實用的分子診斷方法，是實現大規(guī)模人群分子篩查、常規(guī)基因診斷和產前診斷的前提。該文就當前地貧分子診斷技術進展進行綜述，以供參考。關鍵詞：地中海貧血；分子診斷；病理引言地中海貧血（thalassemia，簡稱地貧）是由于珠蛋白基因發(fā)生缺陷;致使珠蛋白鏈合成減少或缺如，使形成血紅蛋白的α-鏈/非α-鏈比例失衡，而導致的一組嚴重威脅人類健康的致死、致殘的遺傳性血液病，主要發(fā)生在地中海沿岸國家、東南亞、非洲和我國南方地區(qū)，保守估計全世界地中海貧血基因攜帶者近2億人，其中包括我國南方廣西、廣東、海南等省份[1]。地中海貧血主要包括α-地中海貧血和β-地中海貧血，而口地貧危害最大。目前實驗室診斷方法有篩查法、分子檢測兩大類，近年來均取得了較大的研究進展。本文重點綜述地貧分子診斷的最新成果并對其優(yōu)缺點與適用范圍加以分析。1地貧的分子病理學機制人類血紅蛋白為兩個α類珠蛋白亞基和兩個β類珠蛋白亞基而組成的四聚體，正常情況下，α類與β類珠蛋白的比例為1∶1。地貧的生化缺陷可引起α-和β-類珠蛋白比例失衡，而導致血紅蛋白量減少的溶血性貧血。根據所累及的珠蛋白類型，臨床上主要常見為α-地貧和β-地貧[2]。α-地貧的分子基礎是α2和（或）αl基因發(fā)生突變，α珠蛋白量合成下降，β類珠蛋白過剩，導致無效造血和紅細胞被破壞。α-地貧突變主要是α珠蛋白基因簇的大片段缺失（～95%），及少部分α2/αl基因點突變（～5%）[3]。β-地貧的分子基礎是β基因發(fā)生突變，β珠蛋白量減少，多余的α珠蛋白沉積在紅細胞膜上而造成紅細胞損壞[4]。β-地貧突變主要是β基因點突變（>99.5%），極少數為β珠蛋白基因簇的大片段缺失。據此，可基于地貧的分子機制特點和血液學表型分別采用不同準確、實用的技術方法檢測地貧基因突變，從而明確診斷[5]。2地貧的篩查方法隨著對地貧研究的日漸深入，研究者已經總結出包括輸血療法、藥物療法、移植療法、基因療法等多種地貧治療方法，但重型地貧的根治尚有一定難度，所以，除加強遺傳咨詢、婚育指導外，最根本的措施是作好產前診斷和篩查，杜絕地貧患兒的出生，以達到預防和優(yōu)生的目的[6]。簡單有效的篩查手段主要有;（1）觀察紅細胞形態(tài);（2）紅細胞計數;（3）血紅蛋白電泳;（4）血紅蛋白理化性質測定;（5）HbA3和Hb-F的定量檢測等。3α地貧的分子診斷α-地貧主要（>95%）是由于α珠蛋白基因缺失導致α珠蛋白鏈合成減少或不合成，是典型的基因缺失型遺傳病，α珠蛋白基因缺失的數目是其臨床分型的依據∶正常人有4個α珠蛋白基因（aqαalaα，2個α2和2個αl）;缺失1個α珠蛋白基因（-α/αα）為靜止型;缺失2個α珠蛋白基因（--/αα或-α/-α）為標準型;缺失3個α珠蛋白基因（--1-α）稱為血紅蛋白H病（HbH）[7];4個α珠蛋白基因均缺失（--/--）的即為HbBart's胎兒水腫綜合征。引起α珠蛋白基因缺失的原因主要是DNA大片段缺失，缺失范圍從2.7Kb到整個基因簇不等。中國南方省份及東南亞地區(qū)，最常見的缺失類型為--SEA（東南亞缺失型）、-α4.2（左缺失）和-α3.7（右缺失）三種。就一個單倍型而言，--SEA缺失2個α基因，-α4.2缺失1個α2基因，-α3.7缺失1個αl基因。（α基因簇結構及常見缺失類型示意圖見圖1）圖1α基因簇結構及常見缺失類型示意圖3.1SouthernBlot分子雜交這種方法是基于DNA片段的缺失而導致的限制性內切酶酶譜改變的原理，被檢樣本DNA經限制性內切酶酶切，再用標記探針與酶切片段雜交，觀察其長度的變化而進行分子診斷。此法推出之初，是用放射性同位素標記探針，故存在放射性污染及同位素半衰期短等缺點。近年來，隨著地高辛及生物素等非放射性標記技術的發(fā)明與應用，在方法學上有了一定的發(fā)展。這種方法結果準確，但DNA用量大，操作步驟繁瑣，費時費力，檢測通量低，不適常規(guī)檢測，，現只作為一種確認手段[8]。3.2跨越斷裂點PCR技術上世紀80年代發(fā)明的PCR（聚合酶鏈式反應）技術，具有較大擴增能力與較高的靈敏性，很快被廣泛應用，α-地貧是最早應用PCR技術進行基因診斷的遺傳病之一。gap-PCR的原理是在缺失區(qū)域兩側設計一對引物，正常情況下片段很長不屬于PCR有效擴增范圍，而當缺失時片段變短，能擴增出特異性的擴增產物，以此特異性擴增產物有無的定性分析方式進行分子診斷。這種方法，是針對缺失部位DNA序列已經清楚，缺失位置固定的缺失類型，以一對引物對應一種缺失類型的方式進行缺失類型分析[9]。然而，基因缺失型α-地貧的缺失具有明顯的異質性，即具有多種缺失類型，不同患者其缺失片段有所不同，隨著多種缺失類型的陸續(xù)發(fā)現，gap-PCR法可通過一對一的、多個PCR擴增反應對各種缺失類型分別進行檢測[10]。3.3多重PCR在單管中進行多重PCR，可簡化操作步驟，減少加樣機會、降低污染的可能性，并可節(jié)約樣品和試劑，降低費用。周玉球等報道的多重PCR方法。通過一次單管PCR反應和瓊脂糖凝膠電泳，就可在4h～5h內同時檢測-SEA、-α3.7、-α4.2三種缺失類型，大大縮短了檢測的時間和降低了試驗的成本。陳萍等報道的的單管多重PCR可同時檢測4種缺失型和2種非缺失型α地貧基因型[11]。這兩種多重PCR檢測方法，都是衍生于Gap-PCR原理，以一對引物對應一種缺失類型進行檢測，且由于-α3.7、-α4.2這兩種缺失類型的斷裂點不明，仍需采用長片段擴增方式，使用特殊的Taq酶及PCR試劑[12]。區(qū)采瑩等所應用的多重PCR國，則是分別基于斷裂點明確的--SEA，以及αl和α2基因片段進行擴增的檢測方式，擴增片段均小于1Kb，因而無須特殊的PCR體系，擴增檢測時間也相應縮短，但其不能準確診斷-α/αα的靜止型α-地貧?？偟膩碚f.關于多重PCR的報道.以國內文獻為主，方法學的原理基本上是基于對各種已知缺失類型進行定性分析仍采用凝膠電泳觀察特異性擴增條帶等操作步驟[13]。3.4Real-TimePCR（實時熒光PCR）技術生物及醫(yī)學科學的發(fā)展，分子診斷大規(guī)模應用，PCR等分子生物學技術已成為臨床診斷及科學研究的基本手段與方法，隨之而來的卻是PCR產物對實驗環(huán)境、實驗器材及實驗試劑的污染等關鍵性難題。針對這些問題，PCR檢測過程盡可能一次性閉管完成，盡可能減少后PCR處理步驟，以避免PCR產物的揮發(fā)及擴散而導致的DNA污染。有文獻報道應用SYBRGreenI實時熒光PCR結合融解曲線，檢測α地貧--SEA、-α3.7、-α4.2這三種缺失類型，并應用到α地貧--SEA的產前診斷和人群篩查[14]。最近，隨著高效熔鏈分析（HRM）技術的發(fā)明及相應儀器的問世，已有關于HRM在基因缺失型α-地貧檢測中的應用，此技術是融解曲線分析的進一步發(fā)展，其靈敏度與準確性大大增高。這些將Gap-PCR結合熒光染料及PCR產物融鏈特性（Tm值）進行分析的方法，無須特異性的探針及凝膠電泳等后PCR處理，且成本較低[15]。由ABI公司推出的TaqMan探針技術，雖然檢測成本有所增加，但源于其高特異性、可定量、可多重檢測等特點，有很好的應用前景。Chan等報道了TagMan實時熒光PCR技術在α地貧--sE缺失中的應用[16]?？傃灾?，雖然目前Real-TimePCR技術應用于缺失型α-地貧分子診斷的報道不多，但從方法學上，此技術實現了一次性閉管操作，有效防止了污染，無凝膠電泳及EB等有毒物質對操作者的損害，并可實現高通量的大規(guī)模檢測，是很好的方法學研究方向。4β地貧的分子診斷1976年，Kan等利用核酸雜交速率的差異，檢測了患者α珠蛋白的不同基因型，被認為是分子診斷誕生的標志性事件。1985年，具有劃時代意義的PCR技術誕生，首發(fā)文章報道的就是HBB的擴增。1988年，PCR等位基因特異寡核苷酸探針（allelespecificoligonucleotide，ASO）技術出現，檢測對象涉及HBB突變。1989年，具有深遠意義的PCR反向斑點雜交（reversedotblot，RDB）技術出現，檢測對象同樣是HBB突變[17]。進入21世紀，各類新型分子診斷技術異彩紛呈，幾平無一例外地用于β-地貧診斷，β-地貧儼然成為分子診斷技術的試金石。4.1PCR反向斑點雜交RDB可以同時檢測樣品中的多個突變，尤其適合β-地貧檢測，故該技術一經出現，便在β-地貧檢測中得以應用。目前國內外主流β-地貧商品檢測試劑多基于RDB技術。作為20世紀80年代末出現的技術，RDB可以說是最具生命力的一種。相比而言，同時出現并得到一時應用的PCR-限制酶切片段長度多態(tài)性（RFLP）和擴增不應突變系統(tǒng)（ARMS）已逐漸淡出β-地貧檢測領域[18]。究其原因,就在于RIDB可以利用多重PCR，一次性擴增出包含突變位點的多個片段，并在一張膜上同時對多個突變位點進行檢測，易實現檢測流程的標準化。相反，無論PCR-RFLP還是ARMS-PCR，在單個反應中都只能檢測1個或少數幾個突變，難以滿足檢測B-地貧數十種突變位點在通量上的要求[19]。4.2基于引物延伸的檢測——微測序技術(minisequencing)HBB全長約1600bp，理論上完全可以通過直接測序實現絕大多數突變的檢測。然而，盡管直接測序法在發(fā)現HBB基因突變上發(fā)揮了無可替代的作用，作為常規(guī)診斷技術，卻存在成本高和耗時長的缺點。因此，迄今直接測序法仍主要作為研究工具使用。相對而言，微測序技術卻在β-地貧的分子診斷上發(fā)揮了十分重要的作用。1990年Syvanen等提出的微測序技術，原理與Sanger測序類似，就是在PCR產物中加人延伸引物，通過引物單堿基延伸確定下游堿基的類型[20]。如果同時加入多個延伸引物，只要這些引物能彼此區(qū)分，就可以同時檢測PCR產物中多個突變位點。微測序技術通過與毛細管電泳、芯片、質譜和變性高效液相色譜結合，已廣泛用于β-地貧突變檢測[21]。例如，2004年我國香港學者Chan等利用芯片平臺，建立了可檢測15種非缺失α-地貧突變和23種β-地貧突變的微測序體系。最近報道的ThalassoChip同樣是一款基于芯片的微測序技術產品，該芯片可以一次同時檢測HBB的57個突變及3個單核苷酸多態(tài)性（SNPs）位點[22]。4.3基于實時PCR平臺的檢測所謂實時PCR.就是在PCR擴增的同時檢測其擴增產物。據此，人們很早就提出了實時PCR檢測基因突變的基本方式，即分別使用不同熒光標記的野生型和突變型探針，根據擴增過程中所產生的熒光信號的類型，判斷樣本的基因型。該檢測方式簡潔直觀，很快被人們接受[\23]。然而，由于實時PCR儀器的熒光檢測通道數有限（一般是4到6個），檢測1個突變需要2個檢測通道，因此，1個實時PCR反應理論上至多能檢測3個突變[24]。對于涉及數十種突變的β-地貧而言，就需要多個反應管，難以滿足臨床上對檢測通量的要求。另一方面，探針的特異性亦難保證，當兩個探針在相同環(huán)境和溫度下同時檢測野生型和突變型時，任何錯配都將導致非特異信號的發(fā)生[25]。然而，隨著MCA應用的增加，FRFT探針的局限性也逐漸顯現出來。首先，此類探針需要匹配的熒光供體和受體對以實現FRET，但滿足FRET的供受體對數目有限，所用標記熒光染料類型特殊，且價格高昂[26];其次，要求實時PCR儀器須有相應的FRET檢測通道，由于多數實時PCR儀器的檢測通道是針對單獨的熒光基團設計，或者不具備針對FRET的檢測通道，或者僅有單個FRET檢測通道，故一直以來，多色MCA主要在專門設計的LightCycler儀器上進行。此外，雙雜交探針設計困難，其中的"錨探針"可能造成檢測盲區(qū)。為消除FRET探針的種種問題，Huang等通過系統(tǒng)比較實時PCR各類熒光探針，提出了采用自淬滅雙標記探針實現MCA的新思路，擺脫了FRET探針的限制，將MCA發(fā)展為通用的多色檢測技術[27]。作者據此在常規(guī)通道實時PCR儀器上，實現了16種β-地貧突變的單管檢測，使MCA的檢測能力邁上了新臺階。利用上述探針，廈門致善生物科技公司開發(fā)出了能夠同時檢測我國24種β-地貧突變的四色MCA試劑盒[28]。2011年，Xiong等報道了該試劑盒的多中心驗證結果，對1022份樣本進行的雙盲分析表明，試劑盒的敏感度和特異度均達100%，操作簡便性大大優(yōu)于測序法和RDB法。同期出版的雜志配發(fā)的評論文章認為"這是一個分子診斷真實評價的出色例子"，所采用的技術"超越了β-地中海貧血本身，可以廣泛用于其他基因突變的篩查"。4.4無創(chuàng)產前診斷β-地貧大規(guī)模人群篩查無疑為產前診斷的實施提供了條件。現階段，產前診斷依然是通過采集絨毛、羊水等有創(chuàng)方式進行，由此引發(fā)的1%流產率嚴重妨礙其有效實施，NIPD自然成為人們心目中的理想途徑。NIPD的第一步是從孕婦外周血中分離出胎兒基因組，方式有兩種，一是分離出胎兒的有核紅細胞，二是直接利用游離的胎兒DNA。前者由于操作復雜，近年來報道較少，但仍有成功的例子，顯示該法依然有發(fā)展的空間。如2008年印度學者3）聯(lián)合采用3種單克隆抗體，從7ml外周血中分離出有核紅細胞，利用巢式PCR富集HBB基因片段，采用RDB法檢測12種HBB基因突變，對100名孕婦中的84名成功實施了β-地貧的NIPD。5結語目前已經報道了600多種地中海貧血基因突變。這些突變具有明顯的區(qū)域或人群特異性，不同的種族群體有自己獨特的基因突變譜。在地中海貧血遺傳診斷的臨床實踐中，使用的試劑盒通常針對該地區(qū)和人群中常見的突變類型。隨著世界范圍內越來越多的新突變被發(fā)現和報道，區(qū)域基因突變譜變得越來越復雜和多樣化。因此，傳統(tǒng)的地中海貧血基因診斷試劑盒在技術方法上存在局限性，傳統(tǒng)的地中海貧血基因診斷不能替代地中海貧血篩查?；蛐鸵恢滦缘幕驹瓌t。地中海貧血基因診斷技術雖然有其局限性，但也具有快速、準確、操作簡單、成本低、易于推廣等優(yōu)點。傳統(tǒng)方法解決傳統(tǒng)問題方便、成本低，操作復雜、步驟復雜、成本高的新技術可以作為傳統(tǒng)方法的補充，彌補傳統(tǒng)方法的缺點?？傊浞至私飧鞣N技術的特點和局限性，并根據課題和實驗室的具體情況選擇合適的方法和有效的策略，從而準確、及時地確定受試者的地貧基因型，更好地了解地貧基因型。分子篩查防控和臨床治療對人群遺傳診斷具有積極而深遠的意義。參考文獻：[1]徐湘民.見于中國人的HPFH和δβ-地中海貧血的分子基礎[J].中華醫(yī)學遺傳學雜志，1998，15（5）∶315-317.DOI∶10.3760/j.issn∶1003-9406.1998.05.017.[2]PornprasertS;WiengkumT;SrithepS.Detectionofalpha-thalassemia-1SoutheastAsianandThaitypeDeletionsandbeta-thalassemia3.5-kbDeletionbySingle-tubeMultiplexReal-timePCRwithSYBRGreenlandhigh-resolutionmeltinganalysis[J].KoreanJLabMed,2011,31(03):138-142.DOI:10.3343/kilm.2038.[3]陳文璟，溫旺榮，蘇運欽等.用巢氏PCR檢測防止香港型地中海貧血漏診[J].臨床檢驗雜志，2014，32（9∶713-715.DOI∶10.13602kijcls.2014.09.24.[4]ColosimoA,GattaV,GuidaVetal.ApplicationofMLPAassaytocharacterizeunsolvedalpha-globingenerearrangements.[J].Bloodcells,moleculesanddiseases,2011,46(2):139-144.[5]蔡武娟.聯(lián)合應用Gap-PCR和MLPA技術檢測β-珠蛋白基因簇大片段缺失[D].廣州醫(yī)科大學，2015.DOI∶10.7666/d.D714819.[6]HuangJW,ShangX,ZhaoY,etal.Anovelfusiongeneandacommona0-thalassemiadeletioncausehemoglobinHdiseaseinaChinesefamily[J].BloodCellsMolecules&Diseases,2013,51(1):31-4.[7]陳碧艷.3例罕見地中海貧血家系分子診斷和產前診斷[J].海南醫(yī)學院學報，2013，19（4）∶452-456.[8]李莉艷，常清賢，靳旺杰等.十個缺失型β-地中海貧血家系的產前診斷[J].中華圍產醫(yī)學雜志，2012，15（10）∶616-618.DOI∶10.3760/cma.j.issn.1007-9408.2012.10.011.[9]杜麗，王繼成，秦丹卿等.泰國缺失型α地中海貧血的家系分析及產前診斷[C].//全國遺傳性疾病診斷與優(yōu)生咨詢研討會論文集.2015∶248-248.[10]闕婷，，李東明，李旺，林飛，徐鈺琪，張強.香港型α-地中海貧血雜合子地中海貧血經驗分析和分子機制[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志，2014，22（12）∶19-20.[2017-09-05].DOI:10.13404/ki.cjbhh.2014.12.007[11]AbuzenadahAM,HusseinIM,DamanhouriGAetal.Molecularbasisofbeta-thalassemiainthewesternprovinceofSaudiArabia:identificationofrarebeta-thalassemiamutations.[J].Hemoglobin:InternationalJournalforHemoglobinResearch,2011,35(4):346-357.[12]Teh,L.K.,George,E.,Lai,MIetal.Molecularbasisoftransfusiondependentbeta-thalassemiamajorpatientsinSabah[J].Journalofhumangenetics,2014,59(3):119-123.[13]吳學東，井遠方，溫建蕓等.造血干細胞移植治療地中海貧血[J].中國組織工程研究，2012，16（23）∶4339-4348.DOI∶10.3969/.issn.1673-8225.2012.23.031.[14]李兵.廣東省地中海貧血流行及防控現狀評價[D].南方醫(yī)科大學，2015.DOI:10.7666/d.Y2910853.[15]Alkindi,S.,AlZadjali,S.,Daar,S.etal.Firstreportofthespectrumofdelta-globingenemutationsinOmanisubjects-iidentificationofnovelmutations[J].Internationaljourmaloflaboratoryhematology,2015,37(2):238-243.[16]張莉，黃偉忠，唐景云等.聯(lián)合應用MLPA和測序技術檢測地中海貧血基因缺陷[J].實用預防醫(yī)學，2014，21（7）∶779-781.DOI∶10.3969/j.issn.1006-3110.2014.07.004.[17]黃海龍，方穎迪，林娜，陳雪美，郭丹華，王燕，林元，徐兩蒲.4種罕見β-地中海貧血基因檢測膜條的制備及其臨床應用[J].中國婦幼保健，2016，（01）∶127-129.[18]LiuJZ,YanM,WangLR,etal.Molecularprenataldiagnosisofal-pha-thalassemiausingreal-timeandmultiplexpolymerasechainreactionmethods[J].Hemoglobin,2008,32(6):553-60.[19]PornprasertS,SukunthamalaK,SacomeJ,etal.Analysisofreal-timeSYBR-polymerasechainreactioncyclethresholdfordiagnosisofthealpha-thalassemia-1SoutheastAsiantypedeletion:appli-cationtocarrierscreeningandprenataldiagnosisofHbBart'shy-dropsfetalis[J].Hemoglobin,2008,32(4):393-402.[20]PornprasertS,PhusuaA,SuantaS,etal.Detectionofalpha-thalassemia-1SoutheastAsiantypeusingreal-timegap-PCRwithSYBRGreenlandhighresolutionmeltinganalysis[].EurJHaematol,2008,80(6):510-4.[21]ChanV,etal.Quantitativepolymerasechainreactionfortherapidprenataldiagnosisofhomozygousalpha-thalassaemia(HbBartshy-dropsfetalis)Ⅲ.BrJHaematol,2001,115(2):341-6.[22]ZesongL,RuijunG,WenZ.Rapiddetectionofdeletionalalpha-thalassemiabyanoligonucleotidemicroarrayJ].AmJHematol,2005,80(4):306-8.[23]YeBC,ZhangZ,LeiZ.Oligonucleotidearrayfordetectionofcom-monseveredeterminantsofalphathalassemia[].JBiotechnol,2005,115(1):1-9.[24]SuwannakhonN,PongsawatkulK,SeeratanachotT,etal.T