應(yīng)用dna重組技術(shù)構(gòu)建大鼠鱗狀神經(jīng)節(jié)神經(jīng)營養(yǎng)因子真核表達(dá)載體

應(yīng)用dna重組技術(shù)構(gòu)建大鼠鱗狀神經(jīng)節(jié)神經(jīng)營養(yǎng)因子真核表達(dá)載體

cndt是一個(gè)含有20-24kd的酸性蛋白質(zhì)，可以顯著促進(jìn)中樞神經(jīng)和周圍運(yùn)動神經(jīng)元的生存，防止因破壞而轉(zhuǎn)移到血管。近年的基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)損傷后采用組織工程方法,將有活性的種子細(xì)胞移植治療神經(jīng)損傷,能促進(jìn)損傷軸突修復(fù)、再生,恢復(fù)部分神經(jīng)功能。近年種子細(xì)胞應(yīng)用的相關(guān)研究逐漸成為神經(jīng)組織工程的熱點(diǎn),肌源性干細(xì)胞也備受廣大學(xué)者關(guān)注。肌源性干細(xì)胞是高度未分化的多潛能細(xì)胞,具有長時(shí)間強(qiáng)大的自我更新能力;在特定刺激下,其可以分化為成骨細(xì)胞,肌細(xì)胞,心肌細(xì)胞,神經(jīng)細(xì)胞等,可以作為神經(jīng)組織工程的理想細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)通過真核表達(dá)載體pEGFP-C3-CNTF的構(gòu)建并轉(zhuǎn)染成肌細(xì)胞,促使成肌細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)CNTF,探討真核表達(dá)載體pEGFP-C3-CNTF轉(zhuǎn)染的成肌細(xì)胞作為神經(jīng)組織種子細(xì)胞的可行性。1材料和方法設(shè)計(jì):隨機(jī)對照的實(shí)驗(yàn)研究。時(shí)間及地點(diǎn):實(shí)驗(yàn)于2011-4/2011-12在遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室完成。1.1菌種和質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)動物:新生3～5d的SD大鼠乳鼠(10g±2g),由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供,動物許可證號:SCXK(遼)2003-2007。菌種和質(zhì)粒:菌種:E.coliDH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存。質(zhì)粒:pDBLeu-CNTF,pEGFP-C3均為本實(shí)驗(yàn)室保存實(shí)驗(yàn)分組:轉(zhuǎn)染pEGFP-C3-CNTF重組質(zhì)粒的成肌細(xì)胞組(成肌-CNTF細(xì)胞)作為實(shí)驗(yàn)組,轉(zhuǎn)染pEGFP-C3空載體的成肌細(xì)胞(成肌-mock細(xì)胞)組作為對照組。1.2重組質(zhì)粒的構(gòu)建和表達(dá)(1)引物設(shè)計(jì)與合成引物設(shè)計(jì)與合成由上海生工生物工程有限公司完成,CNTF引物上游序列為:5,-CTTTCGCAGAGCAAACACCT-3,,下游序列為5,-CATCCCATCAGCCTCATTTT-3,,應(yīng)用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增CNTFcDNA目的片段.1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測所得擴(kuò)增產(chǎn)物是否為目的片段。(2)構(gòu)建真核表達(dá)載體采用分子克隆技術(shù)構(gòu)建其真核表達(dá)載體。對PCR擴(kuò)增的目的片段CNTFp-EGFP-C3質(zhì)粒經(jīng)XhoI和BamHI雙酶切,1.0%瓊脂糖凝膠電泳后膠回收CNTF目的片段和載體pEGFP-C3片段,經(jīng)T4DNA連接酶16℃連接過夜,產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌E.coliDH5α菌株,用含卡那霉素(50ms/L)的LB瓊脂平板培養(yǎng),隨機(jī)挑選10個(gè)單克隆,以菌落為模板進(jìn)行PCR初步篩選。重組真核表達(dá)載體命名為p-EGFP-C3-CNTF。鑒定正確的陽性克隆,在含卡那霉素(50mg/L)的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)過夜,抽提重組質(zhì)粒后,以質(zhì)粒為模板雙酶切鑒定并將陽性克隆進(jìn)行測序。p-EGFP-C3-CNTF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成肌細(xì)胞參照Lipofectamine2000試劑盒(LF2000,Invitrogen公司)說明書采用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)兩組質(zhì)粒(pEGFP-C3-CNTF和pEGFP-C3)轉(zhuǎn)染成肌細(xì)胞。原代培養(yǎng)成肌細(xì)胞生長至70%～80%匯合時(shí),以無血清培養(yǎng)液沖洗細(xì)胞1次。用p-EGFP-C3空質(zhì)粒和pEGFP-C3一CNTF重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成肌細(xì)胞,各轉(zhuǎn)染12孔。分別于轉(zhuǎn)染后24h和48h在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況以檢測轉(zhuǎn)染效率?？股睾Y選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。擴(kuò)增培養(yǎng)獲得的能穩(wěn)定表達(dá)大鼠CNTF的成肌細(xì)胞,命名為成肌-CNTF細(xì)胞,作為實(shí)驗(yàn)組;將作為對照的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-C3空質(zhì)粒的細(xì)胞命名為成肌-mock細(xì)胞。設(shè)β-actin為內(nèi)參,引物設(shè)計(jì),引物上游序列為:5,-GTAAAGACCTCTATGCCAACA-3,,下游序列為:5,-GGACTCATCGTACTCCTGCT-3,,RT-PCR檢測CNTFmRNA的表達(dá)情況。觀察p-EGFP-C3-CNTF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的成肌細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化并鑒定用神經(jīng)元特異性蛋白(NES)鑒定神經(jīng)元樣細(xì)胞,經(jīng)免疫組化染色后,在顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的比例。主要觀察指標(biāo):RT-PCR擴(kuò)增檢測CNTF基因片段;Desmin鑒定成肌細(xì)胞;神經(jīng)元特異性蛋白(NES)鑒定神經(jīng)元樣細(xì)胞,于鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的比例。設(shè)計(jì)、實(shí)施、評估:實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為第一作者在第三作者指導(dǎo)下完成,實(shí)施為第一、二作者,評估為第三作者。1.3統(tǒng)計(jì)分析x=sxs2pegfp-c3-cnrt重組質(zhì)粒的鑒定2.1重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定重組質(zhì)粒pEGFP-C3-CNTF經(jīng)XhoI和BamHI雙酶切后可得到兩條分別為422bp及4726bp的條帶,而pEGFP-C3空質(zhì)粒雙酶切后則只能得到一條4726pb的條帶、經(jīng)與GenBank中公布的基因序列比對,證實(shí)pEGFP-C3-CNTF重組質(zhì)粒插入片段的序列與登記的CNTFcDNA序列完全一致,結(jié)果表明陽性重組質(zhì)粒中包含有CNTF目的基因片段。見圖1。2.2用神經(jīng)元特異性蛋白(NES)鑒定成肌細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞,經(jīng)免疫組化染色后,在顯微鏡下拍照。見圖2。2.3于顯微鏡下計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的比例。實(shí)驗(yàn)組與對照組之間差異有顯著性意義(P<0.05)見下表。不同轉(zhuǎn)染條件下神經(jīng)元樣細(xì)胞的陽性率(xˉ±s?n=5)(xˉ±s?n=5)2.4RT-PCR分析結(jié)果,成肌-CNTF細(xì)胞和成肌-mock細(xì)胞所提RNA均能擴(kuò)增出代表CNTF基因的422bp的條帶和內(nèi)參β-actin基因的條帶,但前者大鼠CNTFmRNA表達(dá)量明顯大于后者,表明在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-C3-CNTF的成肌-CNTF細(xì)胞中大鼠CNTF的mRNA表達(dá)水平明顯增高。如圖3。3pegfp-c3基因質(zhì)粒的制備及真核表達(dá)載體的選擇傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后,由于內(nèi)在的再生能力差和外在的微環(huán)境的抑制,損傷的軸突不能再生。然而近年的基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)損傷后采用組織工程方法,將有活性的種子細(xì)胞移植治療神經(jīng)損傷,能促進(jìn)損傷軸突修復(fù)、再生和恢復(fù)神經(jīng)部分神經(jīng)功能。近年來組織工程討論的熱點(diǎn)之一就是種子細(xì)胞的應(yīng)用,預(yù)期它們在組織工程應(yīng)用領(lǐng)域特別是細(xì)胞移植和基因治療方面前景廣闊,國外已在進(jìn)行基因治療和組織工程的動物實(shí)驗(yàn),并取得較明顯的效果。CNTF作為目前研究最多的神經(jīng)營養(yǎng)因子,它可能在人類運(yùn)動神經(jīng)損傷及肌肉萎縮等運(yùn)動神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療上發(fā)揮重要的作用,研究顯示其能明顯促進(jìn)中樞和周圍運(yùn)動神經(jīng)元存活,防止受損神經(jīng)元退變的功能。近年的基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)損傷后采用組織工程方法,將有活性的種子細(xì)胞移植治療神經(jīng)損傷,能促進(jìn)損傷軸突修復(fù)、再生,恢復(fù)部分神經(jīng)功能。肌源性干細(xì)胞是成年動物或人肌肉組織中特有的成體干細(xì)胞,屬高度未分化的多潛能細(xì)胞,在特定刺激下,可以分化為成骨細(xì)胞,肌細(xì)胞,心肌細(xì)胞,神經(jīng)細(xì)胞等,可以作為神經(jīng)組織工程的理想細(xì)胞。本部分研究首先根據(jù)pEGFP-C3質(zhì)粒上的MCS以及待克隆的目的片段JNK3的開放閱讀框(openreadingframe,ORF)序列選擇XhoI和BamHI酶切位點(diǎn)作為克隆酶切接頭。設(shè)計(jì)CNTF特異性的引物時(shí)在其兩端分別加上XhoI和BamHI的酶切位點(diǎn)及3個(gè)保護(hù)堿基。然后以pDBLeu-CNTF質(zhì)粒為模板,通過PCR的方法獲得大鼠CNTFcDNA編碼區(qū)全長。再將CNTF目的片段和pEGFP-C3質(zhì)粒分別用XhoI和BamHI雙酶切,產(chǎn)生非互補(bǔ)粘端,促使外源CNTF目的片段定向插入至pEGFP-C3載體中。連接產(chǎn)物熱沖擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliDH5α。由于載體帶有Kanr基因,使所有轉(zhuǎn)入載體的細(xì)胞均獲得了抗性,能在含Kana的LB平板上生長成菌落。最后,通過進(jìn)一步酶切和PCR篩選鑒定重組子,并將重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA序列測定,經(jīng)與GenBank中公布的基因序列比對確認(rèn)插入的目的片段的序列準(zhǔn)確無誤,證實(shí)大鼠CNTF真核表達(dá)載體構(gòu)建成功,將其命名為pEGFP-C3-CNTF。構(gòu)建了一個(gè)可在真核細(xì)胞中組成性表達(dá)大鼠CNTF蛋白的pEGFP-C3-CNTF表達(dá)載