青蒿素類藥物作用機制的研究進展

青蒿素類藥物作用機制的研究進展

2011年9月，中國中醫(yī)藥研究所科學家屠龍獲得美國斯拉夫的臨床醫(yī)學獎，贊揚了他在開發(fā)抗癲癇藥物優(yōu)霉素方面的貢獻。與此同時，中醫(yī)類抗癲癇藥物的青霉素已成為中國人民關注的焦點。2010年，瘧疾發(fā)生在非洲、南亞、東南亞和印度洋的亞熱帶地區(qū)。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計，2010年，瘧疾發(fā)生在2.16億株植物中，65.5萬人死亡，86%的受害者在5歲以下的兒童中。青蒿素的發(fā)現(xiàn)是中國20世紀70年代“中國瘧疾防治藥物研究工作協(xié)作項目”(又稱“523”科研項目)中的一項重要成果,中國科學家們的協(xié)作研發(fā)為世界人民抗擊瘧疾做出了重要貢獻.青蒿素對紅內期瘧原蟲有直接殺滅作用,快速高效且毒性低,缺點是半衰期比較短,單獨使用再燃率較高.其他治療瘧疾的藥物,如氯喹、甲氟喹和奎寧等均出現(xiàn)了抗藥株,而青蒿素類藥物自投入使用以來,除在柬埔寨地區(qū)出現(xiàn)青蒿琥酯對瘧原蟲清除效率降低的病例(體外實驗并沒有出現(xiàn)類似的延緩現(xiàn)象),尚無確證的青蒿素類藥物抗性瘧原蟲出現(xiàn).為防止將來青蒿素抗性菌株的出現(xiàn),世界衛(wèi)生組織頒布了“青蒿素聯(lián)合療法”(artemisinincombinationtherapy,ACT).除治療瘧疾的良好效果外,青蒿素在殺滅其他種類寄生蟲,抑制某些癌癥細胞以及抗病毒、治療類風濕等方面也有一定作用.青蒿素的治療效果舉世矚目,但其作用機制至今仍是一個謎,也是一個長期存在爭議的話題.本文將對青蒿素作用機制的研究現(xiàn)狀進行綜述.1青蒿素抗病劑青蒿素,一種具有過氧橋的倍半萜內酯類化合物,分子式C15H22O5,分子量282.33,無色針狀晶體(圖1A).它是從菊科植物黃花蒿中分離到的.中國科學家在獲取青蒿素并確定其結構后,就展開了對其衍生物構效關系的研究,合成并篩選了它的衍生物,如二氫青蒿素、醚類、羧酸酯類和碳酸酯類等.這些衍生物的抗瘧活性大多強于青蒿素,其中青蒿琥酯水劑和蒿甲醚油針劑在1987年被批準生產(chǎn).在氯喹、奎寧等抗瘧藥物不斷出現(xiàn)耐藥株的時候,青蒿素的良好抗瘧效果引起了世界范圍的關注,對于青蒿素作用機制的研究也隨之展開.基于青蒿素結構中的過氧橋或1,2,4-三烷環(huán)(1,2,4-trioxane),設計并合成了一系列化合物[5~9],其中一部分在藥效和穩(wěn)定性方面都較青蒿素有明顯的提高,且部分化合物的分子骨架與青蒿素截然不同(圖1B~D).這些分子的共同特點是具有雙氧橋,加之雙氧橋本身化學性質比較活躍,是已知的自由基來源之一,消除雙氧橋化合物隨之失活,因而目前認為,青蒿素結構中的雙氧橋是關鍵的藥效團,是其發(fā)揮作用必不可少的重要組分,可能在抗瘧疾過程中發(fā)生了氧化還原反應產(chǎn)生自由基,從而破壞瘧原蟲的生長,實現(xiàn)對瘧疾的控制.2青蒿素的激活和青蒿素的作用靶點破解青蒿素作用機制不僅可以加深人們對這種藥物的認識,而且對于其正確使用,如增效、防止抗瘧株的產(chǎn)生,以及新型抗瘧藥物的設計都有重要意義.目前提出的青蒿素作用機制假說基本涉及兩個方面:青蒿素的激活和青蒿素的作用靶點.2.1u3000血紅素參與青蒿素的激活(1)鐵參與青蒿素的激活.u3000青蒿素抗瘧研究中,鐵是大家關注的焦點之一.目前,一種比較普遍的觀點是青蒿素的激活是通過含鐵的途徑進行的.通過監(jiān)測青蒿素產(chǎn)生自由基的過程認為,鐵在青蒿素抗瘧過程中發(fā)揮了重要作用.通過電子順磁共振技術(EPR)及捕獲劑DMPO進一步揭示了二者之間的關系:青蒿素通過一個依賴于鐵的通路產(chǎn)生自由基.如果在反應體系中加入吡哆醛苯甲酰腙(pyridoxalbenzoylhydrazone)和去鐵酮(1,2-dimethyl-3-hydroxypyrid-4-one)這兩種疏水性鐵螯合劑,青蒿素及其衍生物的抑瘧效果將減弱.去鐵敏(desferrioxamine),另一種鐵螯合劑,也降低了青蒿素的作用.Wu等人發(fā)現(xiàn),青蒿素在亞鐵離子存在下可以與半胱氨酸作用,得到胱氨酸及一種新的重排產(chǎn)物.青蒿素分子中的過氧橋結構是其發(fā)揮作用的關鍵藥效團.在青蒿素激活過程中,關于如何打開過氧橋有兩種假說,一種是通過鐵參與還原,均裂過氧橋產(chǎn)生氧中心自由基進而重排形成碳中心自由基[14~16],另一種觀點是鐵起到類似路易斯酸(lewisacid)的作用,不對稱斷裂過氧橋,分子離子化,之后再借助鐵或者非過氧化的氧進行后續(xù)反應[17~20],認為這樣的方式所需能量更低、更穩(wěn)定,且有可能在該過程中產(chǎn)生能對細胞造成損害的活性氧自由基.(2)血紅素(heme)參與青蒿素的激活.u3000瘧原蟲在傳播繁殖過程中有兩個寄主,一個是人體,另一個是按蚊.在人體內為無性繁殖.其長梭形的孢子在肝細胞內形成裂殖體,成熟后會漲破肝細胞進入血液,侵入紅細胞中增殖.它們依靠攝取紅細胞內的血紅蛋白做為自身氨基酸合成的來源,該過程會產(chǎn)生對蟲體不利的分解產(chǎn)物血紅素,血紅素形成三價鐵二聚體(hematin),瘧原蟲體內存在一種機制可以將其轉化成沒有細胞毒性的色素顆粒(hemozoin)累積于細胞質內,即瘧色素.有研究表明,非血紅素的鐵和血紅素中的鐵均能與青蒿素作用.兩種觀點都有相關實驗數(shù)據(jù)支持:對于前者,實驗將一種特異螯合非血紅素來源的鐵離子螯合劑與青蒿素偶聯(lián)之后與未經(jīng)修飾的青蒿素一同進行抑瘧實驗,發(fā)現(xiàn)兩者具有拮抗作用,表明非血紅素來源的鐵對青蒿素有重要作用;而另一部分學者發(fā)現(xiàn),從用青蒿素處理的惡性瘧原蟲菌株中可以分離到血紅素(heme)與青蒿素的復合物,還有體外實驗發(fā)現(xiàn),將青蒿素與不同形式的鐵,包括血紅素、二價鐵離子、脫氧的和氧化的血紅蛋白在相同的條件下進行反應,血紅素與青蒿素反應的效率遠高于其他含鐵分子,表明血紅素對于激活青蒿素起關鍵作用.瘧原蟲寄生于血紅細胞中,血紅素來源豐富.目前,究竟是自由鐵還是血紅素的鐵激活青蒿素還存在爭議.(3)線粒體參與青蒿素的激活.u3000模式生物是研究藥物分子機制的有力工具,釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)作為經(jīng)典模式生物之一,被用于青蒿素類藥物作用機制的探索.通常情況下,釀酒酵母主要依賴糖酵解途徑,在發(fā)酵型培養(yǎng)基(如以葡萄糖為碳源)上的生長狀況更好,此類型的生長過程不需要線粒體供能,而當非發(fā)酵型碳源(如以甘油或乙醇作為碳源)出現(xiàn)時,它們的生長必須依賴于線粒體.研究發(fā)現(xiàn),青蒿素可以抑制釀酒酵母菌在非發(fā)酵培養(yǎng)基上的生長,但是基本不能抑制在發(fā)酵培養(yǎng)基上的生長.這種現(xiàn)象暗示了青蒿素與線粒體的緊密聯(lián)系.通過篩選得到了NDI1,NDE1的突變株,發(fā)現(xiàn)其具有青蒿素抗性.NDI1和NDE1是編碼釀酒酵母線粒體電子傳遞鏈中NADH脫氫酶的基因,這兩個基因在惡性瘧原蟲中存在同源序列,而哺乳動物中不存在.哺乳動物線粒體內與這一結構發(fā)揮相似功能的是由多個亞基組成的呼吸鏈復合物Ⅰ.實驗表明,當敲除NDE1或NDI1基因時,可以觀察到酵母菌對青蒿素的耐受性增強,敏感性降低;過量表達則可增強敏感性.線粒體呼吸鏈抑制劑DPI(NADH脫氫酶抑制劑)的加入可以減緩酵母菌細胞和瘧原蟲細胞對青蒿素的代謝,減弱瘧原蟲和酵母菌對青蒿素的敏感性.基于這一模型,推測青蒿素的還原激活(獲得電子)是通過線粒體的還原物,且很可能是通過獲得電子傳遞鏈中的電子完成的.呼吸鏈在電子傳遞過程中有時會發(fā)生電子泄漏,電子被O2獲得進而產(chǎn)生自由基,而青蒿素恰好又是一種過氧化合物.另值得一提的是,線粒體特別是呼吸鏈有豐富的鐵以及血紅素.(4)其他觀點.u3000對于鐵參與激活青蒿素這一理論,也有部分研究者持不同意見,如Haynes等人在尋找新型青蒿素衍生物過程中發(fā)現(xiàn),有兩種青蒿素烷氨基衍生物表現(xiàn)出了比青蒿素更好的抗瘧作用,但是其和鐵的作用微弱.此外,對其他一些可以介導反應形成過氧化物并作為自由基來源的分子也有研究和報道.在這些假說中,異源分解過氧橋先于重排發(fā)生,導致了破壞細胞大分子的羥基自由基的生成.另有報道也反駁了鐵在青蒿素中的作用,同時提出由二價鐵介導的碳自由基的形成不是青蒿素發(fā)揮抗瘧作用的原因.近來有報道認為,青蒿素抑制瘧疾的活性需要血紅蛋白的消化和吸收,當抑制了血紅蛋白酶的活性,干擾血紅蛋白降解通路或者直接從培養(yǎng)基中去除紅細胞裂解產(chǎn)物,都可以顯著減弱青蒿素的抑瘧活性.綜合上述觀點,有一些問題還存在爭議,例如,若鐵確實參與了青蒿素的作用過程,那么鐵在體內的作用是直接的還是間接的,是以何種形式、在哪一階段、以何種機制參與反應等.一種相對被認可的結論是活性氧自由基(ROS)的產(chǎn)生是對細胞造成損傷的重要原因之一.因此也可以存在這樣的假設,認為可能是青蒿素激活產(chǎn)生少量的ROS,這些ROS與鐵相互作用,擾亂了鐵平衡,又激化了更多ROS的生成,從而對細胞造成損傷.有關青蒿素激活的各種觀點假說還需更多體內實驗進行探究.2.2u3000結u3000論嵌入在青蒿素倍半烯萜內酯骨架中的雙氧橋對青蒿素抗瘧有著至關重要的作用是進行機制研究的最初線索,而自由基的生成與雙氧橋的斷裂有著密切的關系.早在20世紀80年代末期,自由基在青蒿素類藥物中的作用就得到了實驗的證實.研究發(fā)現(xiàn),在體外實驗中,自由基清除劑可以拮抗青蒿素類藥物的抗瘧活性,同時自由基生成劑能增強其抗瘧作用.相關的體內實驗也證實了這一關系.然而,青蒿素的作用又與通常意義上引起損傷的典型氧化劑不同.由于青蒿素的一個分子一次反應只能產(chǎn)生一個自由基,實驗觀察到的內源性氧化產(chǎn)物只在較高的藥物施用濃度下才能被觀察到,而實際殺滅瘧原蟲時青蒿素的用量很低,在nmol/L級,所以青蒿素應存在著其特殊的作用方式.(1)血紅素的烷基化.u3000不少研究認為,血紅素既是激活青蒿素類藥物的裂解還原激活劑,又是其發(fā)揮作用的重要靶標,青蒿素對血紅素的修飾、烷基化是殺滅瘧原蟲的原因.早期的血紅素模型中青蒿素的作用機制與奎寧相仿,都是作用于液泡,通過影響血紅素的脫毒來抑制青蒿素.這一觀點有一些相關實驗支持,如當14C標記的青蒿素加入被紅細胞侵染的惡性瘧原蟲時,輻射劑量測量顯示瘧色素中有大量青蒿素.通過高效液相色譜,可以在試管中分離血紅素-青蒿素復合物,說明兩者之間有生理聯(lián)系.青蒿素抑制液泡中蛋白水解酶的活性,體內和體外實驗都表明青蒿素可以與血紅素結合.推測認為,青蒿素的抗瘧作用可能是由烷基化血紅素產(chǎn)生的瘧色素引起的,也可能是由于形成了一種還原性更強的環(huán)境導致的.在被感染的小鼠中也觀察到了烷基化的血紅素.體外實驗中化學合成血紅素-青蒿素復合物能抑制血紅素聚合過程,導致毒性血紅素的釋放和瘧原蟲的死亡.一些青蒿素的衍生物雖可以與卟啉產(chǎn)生碳自由基,但不能發(fā)生烷基化反應,經(jīng)過檢測發(fā)現(xiàn)這些衍生物也沒有抗瘧活性.研究還發(fā)現(xiàn),合成的有抑瘧活性的1,2,4-三烷衍生物能與卟啉發(fā)生反應.由此認為,烷基化血紅素是發(fā)揮抗瘧活性的重要因素.然而,另一些實驗結果和血紅素理論有一定沖突.例如,紅細胞內的瘧原蟲實驗發(fā)現(xiàn),青蒿素的施用沒有減少瘧色素的含量,表明青蒿素通過抑制瘧色素的形成發(fā)揮作用的結論有待修正.隨后研究發(fā)現(xiàn),10-脫氧二氫青蒿素是一種有效的抗瘧藥物,但是并不抑制瘧色素的形成.也有研究發(fā)現(xiàn),水解穩(wěn)定、血紅素惰性的化合物仍然具有很好的抗瘧特性.此外,Ro40-4388,一種限制血紅素降解第一步反應的蛋白酶抑制劑,與氯喹有拮抗作用,與青蒿素既無拮抗作用也沒有協(xié)同作用,提示血紅素對于青蒿素的抗瘧作用不是必需的.最近,在CO環(huán)境下進行了青蒿素抗瘧作用檢測,實驗依據(jù)CO會與血紅素結合,形成羰基血紅蛋白(CO-Hb-Fe(Ⅱ))或CO-hemeFe(Ⅱ),可能會掩蓋青蒿素與血紅素的作用.結果顯示,在CO環(huán)境下,青蒿素效果好,而血紅素惰性的青蒿素衍生物效果下降,說明Hb-Fe(Ⅱ)或heme-Fe(Ⅱ)沒有參與青蒿素抗瘧作用.因而對于血紅素理論的修正觀點認為,血紅素只是一種激活劑,不是重要的靶標,除了激活以外,血紅素可能與青蒿素的降解有關而不是增強它的功能.(2)蛋白靶點理論.u3000青蒿素的一個鮮明特點就是對瘧原蟲有強烈的特異性而對人不產(chǎn)生副作用,這使得人們推測青蒿素可能會在瘧原蟲體內特異激活,或者瘧原蟲體內存在著對青蒿素的特異性靶標.對于大部分藥物來說,都存在著較為專一和特異的靶標.(ⅰ)PfATP6靶點理論.u3000這一靶點理論曾風靡一時,源自于2003年Nature上的一篇文章,提出青蒿素特異地抑制惡性瘧原蟲的肌漿內質網(wǎng)鈣ATP酶(PfATP6).作者認為,青蒿素與毒胡蘿卜素在結構上有一定相似性(圖1),而后者能特異性結合并抑制肌漿內質網(wǎng)鈣ATP酶(SERCA).為了探究青蒿素與瘧原蟲SERCA間的關系,以及在扼殺瘧原蟲過程中發(fā)揮的作用,將PfATP6在非洲爪蟾卵母細胞中進行了表達.結果發(fā)現(xiàn),青蒿素對PfATP6具有強大且特異的抑制效果.因此,提出青蒿素結合PfATP6發(fā)揮功能的理論.后續(xù)研究發(fā)現(xiàn),當PfATP6263位亮氨酸和對應的哺乳動物SERCA255位的谷氨酸進行互換,它們的抑制效果也隨之改變.一時間,PfATP6理論備受關注.但是,近年來一些與此相仿的嵌合實驗,針對一系列抗瘧藥,包括青蒿素及其衍生物、奎寧類藥物和其他一些過氧化物與毒胡蘿卜素結合,實驗結果沒有發(fā)現(xiàn)上述關系.值得注意的是,某些原來用于支持這一學說的實驗不能被重復.青蒿素結構中的過氧橋對抗瘧作用的發(fā)揮有重要意義,PfATP6模型認為,青蒿素與毒胡蘿卜素作用相似,都是作用在瘧原蟲的肌漿內質網(wǎng)鈣ATP酶上并最終導致瘧原蟲死亡.但是,毒胡蘿卜素并沒有過氧橋結構.另外,構效研究結果表明,許多結構不相同的衍生物都展現(xiàn)出了抗瘧活性,但是對于PfATP6的結合似乎更依賴于分子骨架而非過氧橋,對于結構千差萬別的各種衍生物分子而言,如何統(tǒng)一青蒿素類藥物的抗瘧機制非常困難.最近,青蒿素與毒胡蘿卜素之間的結構相似性也受到了質疑,認為這兩種分子結構相似度極有限.有研究報道,在瘧原蟲體內將野生型PfATP6基因分別替換成含有L263E,S769N的突變型,用青蒿素及衍生物處理后并未觀察到明顯的IC50變化,這對PfATP6靶點理論構成強烈的沖擊.在酵母菌中異源表達PfATP6并進行純化后,發(fā)現(xiàn)其與毒胡蘿卜素的親和性較低,而與環(huán)匹阿尼酸(cyclopiazonicacid)的親和性較高,同時也未觀察到青蒿素對它的抑制作用.其他類似的研究也支持這一結果.總之,這個理論不再被看好,人們認為,PfATP6即使可以作為其他藥物的靶標,也不太可能是青蒿素的作用靶點.(ⅱ)其他蛋白靶點理論.u3000除了PfATP6靶點理論,還有研究提出了其他一些蛋白,被認為可能是青蒿素的作用靶標,但目前證據(jù)較少,說服力比較薄弱.其中包括轉譯控制腫瘤蛋白(TCTP)、消化泡上的膜轉運蛋白PfMDR1、PfCRT、半胱氨酸蛋白酶家族成員falcipain-2、消化泡里的瘧原蟲富組氨酸蛋白PfHRPⅡ、嘌呤核苷磷酸化酶(PfPNP)、肽脫甲酞基化酶(PfPDF)和核糖-5-磷酸異構酶(PfRpiA)等.近來有研究報道,在坦桑尼亞實地考察各種抗藥性改變的菌株中,Pfcrt76位和Pfmdr186位,Pfdhfr的51,59和108位有部分病例存在突變,但是PfATP6的263和769位都沒有發(fā)現(xiàn)突變.另外,這些在瘧原蟲中預測的青蒿素作用靶點,如PfATP6,TCTP,PGH1在酵母菌中都有類似物,敲除酵母菌中編碼這些蛋白的同源基因并檢測這些菌株對青蒿素的敏感性,結果發(fā)現(xiàn)除mdl2Δ和pmr1Δ在非發(fā)酵培養(yǎng)基中不能正常生長、不能檢測青蒿素敏感性以外,其他的菌株都沒有表現(xiàn)出比野生型對照更敏感的表型;進而在酵母菌中過表達MDL2和PMR1基因,菌株也沒有表現(xiàn)出對青蒿素的抗性,推測這些靶點在青蒿素抑瘧過程中可能不是唯一的或者不是發(fā)揮主要作用的.(3)線粒體模型.u3000瘧原蟲的生長需要有功能的線粒體.加入阿托伐醌(Atovaquone)(一種抗瘧藥物),能抑制呼吸鏈復合物Ⅲ的活性,破壞瘧原蟲線粒體功能從而導致蟲體死亡,達到抑瘧效果.在建立了用酵母菌進行青蒿素作用機制研究的模型后,實驗發(fā)現(xiàn),青蒿素可以直接作用于瘧原蟲線粒體.青蒿素的加入可以誘導瘧原蟲和酵母菌的線粒體腫脹,產(chǎn)生大量的ROS,引起線粒體的去極化和膜電勢降低,損害線粒體功能,但青蒿素對鼠肝細胞的線粒體就沒有這樣的作用.當加入ROS清除劑,如DPPD、依達拉奉(edaravone)時,青蒿素的抗瘧和去極化作用能被拮抗,其他一些ROS清除劑,如二硫蘇糖醇(dithiothreitol)、α-生育酚(alpha-tocopherol)與青蒿素的拮抗作用也有報道.另外,采用兩種不同的線粒體通透性轉移孔抑制劑均可以拮抗青蒿素的抑瘧效果.根據(jù)線粒體模型,青蒿素可能不是直接作用于某一個蛋白而使線粒體失活,而可能是通過激活產(chǎn)生ROS或更多非特異破壞性自由基對細胞造成傷害,也有可能涉及多個代謝通路,但目前對其具體的作用過程尚不清楚,還需更多的實驗進行探索.也有研究對線粒體模型表示質疑.使用過氧化物處理紅內期瘧原蟲后,未觀察到線粒體形態(tài)上的明顯變化.當用熒光染料LysoSensorBlue和Rhodamine123分別標記食物泡和線粒體時,可以在4h后觀察到青蒿素對食物泡的破壞,但線粒體沒有變化,從而認為線粒體喪失功能并不是青蒿素類藥物發(fā)揮作用的早期事件.但是,也有較早期的報道稱,對感染了帕氏鼠瘧原蟲的小鼠施用[3H]-二氫青蒿素,可以在30min時觀察到線粒體的膨大.另有報道,線粒體形態(tài)上的變化是早期事件.出現(xiàn)這些不同的結果可能是實驗靈敏度的差別所致,顯微鏡下形態(tài)學上沒有檢測到明顯的線粒體變化并不能說明其功能沒有發(fā)生變化.(4)其他假說.u3000正如很多寄生蟲一樣,瘧原蟲體存在著較豐富的還原型谷胱甘肽(GSH),當蟲體食物泡分解血紅蛋白時,GSH能夠幫助蟲體清除代謝過程中產(chǎn)生的過氧化物和自由基,實現(xiàn)解毒功能.Wang和Wu分離得到了青蒿素與GSH在少量Fe催化下的復合物,該發(fā)現(xiàn)對研究青蒿素的抗瘧機制有提示作用.此外,還有一些研究認為青蒿素作用影響了瘧原蟲膜的合成、輔酶A的功能、抑制細胞色素酶等,但是支持這些猜測的實驗數(shù)據(jù)相對較少.3細胞毒性方面近年來,有關青蒿素類藥物抗腫瘤的研究日益增多.青蒿素類藥物不僅在瘧疾治療方面效果顯著,還可以在體外選擇性地抑制多種腫瘤細胞,如白血病、結腸癌、鼻咽癌和宮頸癌細胞等,對黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌等也有一定的抑制作用,毒副作用較小,且與經(jīng)典的化療藥物無交叉耐藥性.因而,有關青蒿素類藥物的抗腫瘤機制的研究以及基于此開發(fā)抗腫瘤新藥成為青蒿素研究的熱點.青蒿素及其衍生物可以在一定程度上抑制腫瘤細胞的增殖.目前,提出的抗腫瘤機制主要有:(1)與鐵反應產(chǎn)生自由基,發(fā)生烷基化等導致細胞毒性;(2)誘導細胞凋亡;(3)損傷腫瘤細胞線粒體;(4)調控腫瘤相關基因的表達量;(5)延遲或抑制細胞周期,影響腫瘤細胞的DNA合成;(6)影響免疫系統(tǒng);(7)抑制腫瘤新生血管的生成等.當然,這一過程也有可能是多環(huán)節(jié)、多通路的