蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在藥物發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在藥物發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)和技術(shù)的研究進(jìn)入了后基因組時(shí)代。研究人員越來(lái)越意識(shí)到，僅僅完成對(duì)各組的測(cè)量序列是不夠的。生物功能的解釋變得越來(lái)越重要。這項(xiàng)研究的重點(diǎn)逐漸從獲取遺傳因素信息轉(zhuǎn)變?yōu)檠芯窟z傳因素的功能。蛋白質(zhì)是生物功能的主要體現(xiàn)者,它通過(guò)其自身特有的活動(dòng),例如修飾加工、轉(zhuǎn)運(yùn)定位、結(jié)構(gòu)變化、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用、蛋白質(zhì)與其它生物分子的相互作用等,控制和調(diào)節(jié)著諸多的生命活動(dòng)。蛋白質(zhì)組是指某一物種、個(gè)體、器官、組織或者細(xì)胞基因組的全部蛋白質(zhì)產(chǎn)物的表達(dá)譜,或稱一種細(xì)胞內(nèi)存在的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)是指研究蛋白質(zhì)組的科學(xué),本質(zhì)上是在大規(guī)模水平上研究蛋白質(zhì)的特征,包括蛋白質(zhì)的表達(dá)水平、翻譯后的修飾、蛋白與蛋白相互作用等,由此獲得蛋白質(zhì)水平上的關(guān)于疾病發(fā)生,細(xì)胞代謝等過(guò)程的整體而全面的認(rèn)識(shí)。近年來(lái),蛋白質(zhì)組學(xué)有了長(zhǎng)足的發(fā)展,技術(shù)已經(jīng)趨于成熟,并廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域,其中在藥物的靶點(diǎn)確認(rèn)、藥物作用機(jī)制研究等方面發(fā)揮出了其極大的技術(shù)優(yōu)勢(shì),明顯提高了藥物發(fā)現(xiàn)的效率。近10年來(lái),國(guó)內(nèi)外發(fā)表的相關(guān)論文已達(dá)3千余篇。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于藥物研究的各個(gè)階段,其技術(shù)路線如Fig1所示。1基本方法和新技術(shù)1.1凝膠染色的應(yīng)用最經(jīng)典的技術(shù)路線為電泳技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)的聯(lián)用。這種方法適用于大多數(shù)樣本,包括細(xì)胞(如原代培養(yǎng)細(xì)胞或各種細(xì)胞系)、組織(如肝臟、腦、腎等)、體液(如血清、腦脊液、尿液)等。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)通常包含3組樣品:正常對(duì)照樣品、疾病模型樣品以及藥物處置樣品。疾病模型不論細(xì)胞模型還是整體動(dòng)物模型,都應(yīng)該選擇與臨床疾病病理生理和發(fā)病機(jī)制相近或類似的模型。將這些樣品根據(jù)需要制備總蛋白、膜蛋白、核蛋白或是富集糖蛋白等,然后,通過(guò)除鹽、除核酸或去除白蛋白等處理減少對(duì)電泳有干擾的物質(zhì)。在同樣條件下制備和處理后的蛋白質(zhì)樣品在同樣條件下通過(guò)一維電泳或二維電泳(two-dimensionalgelelectrophoresis,2-DE)進(jìn)行分離。電泳后對(duì)凝膠進(jìn)行染色,常用的方法如考馬斯亮藍(lán)染色、硝酸銀染色、銀藍(lán)染色和熒光染色。銀藍(lán)染色是一種改進(jìn)的考馬斯亮藍(lán)染色方法,靈敏度明顯高于普通考馬斯亮藍(lán)染色,而比硝酸銀染色法低,但操作要求不高,染色條件亦容易控制,成本相對(duì)較低,質(zhì)譜兼容性好,它的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。凝膠染色后利用凝膠成像系統(tǒng)和專門的分析軟件(如PDQuest、ImageMaster2DPlatinum等)對(duì)凝膠上的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)進(jìn)行成像和定量分析,并且對(duì)不同組別相同位置差異最大的斑點(diǎn)或感興趣的斑點(diǎn)進(jìn)行精確切取。然后對(duì)這些蛋白質(zhì)進(jìn)行膠內(nèi)酶切,利用胰蛋白酶等蛋白酶將凝膠內(nèi)的蛋白水解成為肽段,得到的肽段混合物在生物質(zhì)譜系統(tǒng)中進(jìn)行分析,最終得到蛋白質(zhì)肽段的相關(guān)數(shù)據(jù)。1.2熒光標(biāo)記物標(biāo)記的應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)主要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)為雙向電泳、生物質(zhì)譜及生物信息學(xué)。此外,一些新的技術(shù)也不斷被開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。熒光二維差異凝膠電泳(fluorescenttwodimensionaldifferencegelelectrophoresis,2D-DIGE)是近年來(lái)出現(xiàn)的一種新的方法。這種方法是分別用不同的熒光染料標(biāo)記不同組樣品中的蛋白質(zhì),然后所有樣品在一塊膠上進(jìn)行二維電泳的分離,最后通過(guò)熒光掃描技術(shù)分析結(jié)果。它利用分子量和電荷匹配的可用光譜分開(kāi)的CyDyeDIGE熒光標(biāo)記物(Cy2、Cy3、Cy5)預(yù)先標(biāo)記蛋白樣品。這3種熒光染料化學(xué)結(jié)構(gòu)上相似,分子量接近,帶有相同的活化基團(tuán)-NHS脂,可以特異性的標(biāo)記在賴氨酸殘基的ε氨基上,由于3種染料均帶有一個(gè)正電荷,這樣,3種熒光標(biāo)記物標(biāo)記后的蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不會(huì)發(fā)生改變,保證了不同樣品中的相同蛋白質(zhì)可以泳動(dòng)到相同的位置。但是,它需要專門的儀器設(shè)備(如IPGphor3/EttanDALT電泳系統(tǒng)、Typhoon多功能激光共聚焦掃描儀等)進(jìn)行檢測(cè),且熒光試劑比較昂貴,目前較難廣泛應(yīng)用。近年來(lái),一種新的蛋白質(zhì)組學(xué)定量技術(shù)開(kāi)始用于藥物新靶點(diǎn)的篩選。穩(wěn)定的同位素之間具有“輕”、“重”之分,但其化學(xué)性質(zhì)是相同的,這樣,被同位素標(biāo)記的蛋白在分離純化時(shí)具有相同的特性,而隨后在質(zhì)譜鑒定中又能根據(jù)質(zhì)量數(shù)的差異被區(qū)分開(kāi)。這種蛋白質(zhì)組學(xué)定量技術(shù)研究蛋白質(zhì)相互作用就是利用這一原理,用穩(wěn)定同位素分別標(biāo)記不同的樣品,之后將標(biāo)記和未標(biāo)記的樣品以等量混合,進(jìn)行酶解后再用質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)它們的相對(duì)豐度。Okamura等利用這種技術(shù)對(duì)腎細(xì)胞癌樣本進(jìn)行了研究。此外,這種蛋白質(zhì)組學(xué)定量技術(shù),也可以用于藥物靶點(diǎn)的確認(rèn)。此外,應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)的新技術(shù)還有:在酵母雙雜交系統(tǒng)的基礎(chǔ)上產(chǎn)生的大規(guī)模酵母雙雜交法、三雜交系統(tǒng)、單雜交系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物雙雜交系統(tǒng)、反向酵母雙雜交系統(tǒng)等技術(shù)、噬菌體展示文庫(kù)技術(shù)、pull-down技術(shù)、蛋白酶足跡法等。這些新方法使蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在藥物研究中有了更加廣闊的應(yīng)用前景。2白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在藥物研究中的應(yīng)用近年來(lái),隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的快速發(fā)展,蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在藥物研究領(lǐng)域有著越來(lái)越多的應(yīng)用,為高通量、特異性、快速的進(jìn)行藥物相關(guān)研究提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持。2.1蛋白質(zhì)組學(xué)研究藥物靶點(diǎn)是指藥物在體內(nèi)的作用結(jié)合位點(diǎn),包括基因位點(diǎn)、受體、酶、離子通道、核酸等生物大分子。篩選與確定新的藥物作用靶點(diǎn)不僅為揭示藥物的作用機(jī)理提供了重要信息,而且對(duì)新藥的開(kāi)發(fā)研制、建立篩選模型、發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物等也具有重要意義。Weingarten等用二維電泳和生物質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析,尋找與其功能相關(guān)的蛋白靶點(diǎn),以期找到用于治療多發(fā)性硬化癥等免疫系統(tǒng)疾病的新藥物靶點(diǎn)。Freedland等借助蛋白質(zhì)芯片發(fā)現(xiàn)神經(jīng)內(nèi)肽酶CD10可能成為前列腺癌的診斷治療和抗前列腺癌藥物治療的新靶點(diǎn)。Hu等對(duì)法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑的抗癌作用機(jī)制進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)研究。他們對(duì)藥物作用前后的卵巢癌細(xì)胞總蛋白進(jìn)行了雙向電泳以及質(zhì)譜分析,發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白70(heatshockprotein,HSP70)在藥物作用后表達(dá)上調(diào),然后利用熱休克蛋白抑制劑和酶聯(lián)免疫吸附分析進(jìn)行了后續(xù)研究,他們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白70能夠?qū)Ψ峄D(zhuǎn)移酶導(dǎo)致的癌細(xì)胞凋亡起到保護(hù)作用,而熱休克蛋白70的抑制可能成為卵巢癌治療的新靶點(diǎn)。2.2不同藥物對(duì)點(diǎn)囊菌b.c和prc8表達(dá)的影響藥物作用機(jī)制研究是藥物藥效學(xué)研究的重要內(nèi)容。值得一提的是,蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的高通量特點(diǎn)為以多靶點(diǎn)、作用復(fù)雜為特點(diǎn)的傳統(tǒng)中藥的作用機(jī)制研究帶來(lái)了新的希望。本課題組應(yīng)用二維電泳與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),在帕金森病小鼠模型上對(duì)中藥成分松果菊苷的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)膽綠素還原酶B可能為其作用過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白之一。此外,我們還進(jìn)行了嗎啡依賴分子機(jī)制的蛋白質(zhì)組學(xué)研究。利用嗎啡依賴大鼠模型,我們研究了嗎啡成癮過(guò)程中背根神經(jīng)節(jié)蛋白質(zhì)表達(dá)的變化,發(fā)現(xiàn)醛縮酶C和PRC8表達(dá)水平發(fā)生了明顯變化,這種變化具有時(shí)間規(guī)律性和腦區(qū)特異性,提示它們可能與嗎啡耐受相關(guān)。Steiner等通過(guò)分析抑制素類降膽固醇化合物對(duì)小鼠肝臟蛋白質(zhì)組的影響,從藥物治療前后表達(dá)變化的蛋白質(zhì)中鑒定出HMG-CoA合成酶(膽固醇合成途徑的關(guān)鍵酶之一),從而闡明了該類降膽固醇藥物的作用機(jī)制。喹啉用于治療瘧疾、關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病已有多年,但其機(jī)制不明。利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)很快發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞膜上的ALDH1和QR2兩種蛋白和喹啉有良好的結(jié)合,進(jìn)而確定ALDH1和QR2為喹啉類藥物的靶點(diǎn)。Bruneau等則應(yīng)用該技術(shù)對(duì)白色念珠菌在給吡啶類藥氟康唑和伊曲康唑以及mulundcadin類藥物后的蛋白表達(dá)的變化,發(fā)現(xiàn)mulundcadin類藥物作用機(jī)制為抑制1,3-D-葡聚糖合成酶的表達(dá),而吡啶類藥的作用機(jī)制為抑制麥角固醇合成酶的表達(dá)。Bantscheff等利用該技術(shù)對(duì)臨床使用的ABL激酶抑制劑的作用機(jī)制進(jìn)行了研究,結(jié)果驗(yàn)證了伊馬替尼(Imatinib,Gleevec)、達(dá)沙替尼(Dasatinib,Sprycel)和Bosutinib的已知作用靶點(diǎn):ABL和SRC激酶家族,并發(fā)現(xiàn)了Imatinib的新作用靶點(diǎn):受體酪氨酸激酶DDR1和氧化還原酶NQO2。2.3肝臟毒性研究蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在毒理學(xué)方面的應(yīng)用還處于起步階段,研究主要集中在肝臟、腎臟毒性和致癌性等機(jī)制研究。Hiyoshi等利用該技術(shù)研究了四氯化碳對(duì)肝臟的毒理作用,發(fā)現(xiàn)右旋多巴鉻變位酶可能是一個(gè)具有肝臟保護(hù)作用的關(guān)鍵蛋白。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,其在毒理學(xué)相關(guān)研究中還會(huì)有更加廣泛的應(yīng)用。2.4耐藥細(xì)菌相關(guān)耐藥在癌癥、感染等疾病的治療中,抗腫瘤、抗菌以及抗病毒等藥物的耐藥問(wèn)題已經(jīng)成為相關(guān)疾病難治療、易復(fù)發(fā)的主要原因之一。關(guān)于耐藥機(jī)制的探討已經(jīng)成為了抗菌藥物領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。利用該技術(shù),研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種與耐藥相關(guān)的蛋白,如:磷酸丙糖異構(gòu)酶、HSP27、Sorcin等可能與胃癌多藥耐藥相關(guān);線粒體轉(zhuǎn)錄因子A、組蛋白H2B、組蛋白H4、核糖體蛋白L3等可能與結(jié)腸癌5-氟尿嘧啶耐藥相關(guān);Sigma調(diào)控因子RpoD和膜孔蛋白F可能與銅綠假單胞菌多重耐藥相關(guān)等。這些蛋白的鑒定為深入研究藥物耐藥性產(chǎn)生機(jī)制提供了線索,而且對(duì)進(jìn)一步篩選具有潛在價(jià)值的抗多重耐藥的藥物治療靶點(diǎn)具有參考價(jià)值。2.5疾病篩查和藥物作用相關(guān)的蛋白質(zhì)近年來(lái),蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)也被廣泛應(yīng)用于臨床研究中。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)高通量、大規(guī)模的優(yōu)勢(shì)在臨床藥物研究中得以充分發(fā)揮。例如:根據(jù)不同病理過(guò)程中蛋白質(zhì)的種類和數(shù)量的變化,篩選疾病特異性發(fā)生變化的蛋白質(zhì),把這些特異的與疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)作為生物標(biāo)志物進(jìn)行疾病篩查和分期、分型;根據(jù)不同治療、用藥階段蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生變化的情況,篩選病程、藥物作用相關(guān)的蛋白,利用這些蛋白標(biāo)志物進(jìn)行病程分析和用藥時(shí)機(jī)的選擇等;根據(jù)生物標(biāo)志物在不同疾病中的變化,從而辨別疾病的性質(zhì)和進(jìn)程,對(duì)預(yù)后進(jìn)行判斷等。Eberini等研究了佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠模型服用非甾體類抗炎藥前后血清蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜的變化,發(fā)現(xiàn)不同的藥物對(duì)血清蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響不同,而且血清蛋白表達(dá)水平的變化與