賁門腺癌中g(shù)fbr2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)及其與gf-

賁門腺癌中g(shù)fbr2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)及其與gf-

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（tgf-a）是1983年從人血小板中成功提取的一個(gè)多功能因素。它對(duì)各種細(xì)胞都有刺激和抑制作用，具有廣泛的生理效果，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的分泌、分離、粘附和死亡。研究表明,TGF-β超家族成員通過(guò)膜受體介導(dǎo)將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi),TGF-β受體表達(dá)缺失是腫瘤發(fā)生的一個(gè)重要原因。TGF-βⅡ型受體(transforminggrowthfactor-betareceptortype2gene,TGFBR2)基因定位于染色體3p22,其失活突變位點(diǎn)較多,尤其在人類腫瘤中較為多見。TGFBR2的基因突變、純合子基因缺失、雜合性丟失、大量的基因重排和基因畸形轉(zhuǎn)錄本在多種腫瘤中均有報(bào)道。最近研究表明,在某些腫瘤中TGFBR2基因可發(fā)生啟動(dòng)子區(qū)高甲基化,從而導(dǎo)致其失去活性。但是,目前國(guó)內(nèi)外尚未見有關(guān)TGFBR2在賁門腺癌中甲基化狀態(tài)的相關(guān)報(bào)道。本研究擬檢測(cè)賁門腺癌中TGFBR2基因的甲基化狀態(tài)及其與TGF-β1蛋白表達(dá)的相關(guān)性,并結(jié)合臨床資料探討其與各種病理指標(biāo)之間的關(guān)系,為確定TGFBR1基因甲基化及TGF-β1蛋白過(guò)表達(dá)在賁門腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1反轉(zhuǎn)錄試劑盒蛋白酶K購(gòu)自Merck公司;氫醌和亞硫酸氫鈉購(gòu)自Sigma公司;WizardDNA純化試劑盒購(gòu)自Promega公司;TRIzol購(gòu)自Invitrogen公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒(ReverseTranscriptionSystemA3500)購(gòu)自Promega公司;所有引物均由北京賽百盛生物工程公司合成;第一抗體為兔抗人TGFBR2多克隆抗體(sc-400)和兔抗人TGF-β1多克隆抗體(sc-146),均購(gòu)自SantaCruz公司;免疫組織化學(xué)染色過(guò)程采用的即用型免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。1.1.2腫瘤的病理分型及標(biāo)本內(nèi)容研究對(duì)象均來(lái)自河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院2004年2月—2007年10月的賁門腺癌手術(shù)患者,共110例,其中男性85例,女性25例,年齡范圍為38～78歲,平均年齡58.2歲。按照UICC標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行TNM分期,110例腫瘤患者中Ⅰ期有7例(6.4%),Ⅱ期有42例(38.2%),Ⅲ期有46例(41.8%),Ⅳ期有15例(13.6%)。按照腫瘤的病理學(xué)分級(jí),47例(42.7%)為高分化,39例(35.5%)為中等分化,24例(21.8%)為低分化。全部患者在術(shù)前均未經(jīng)化療和放療。每例患者的手術(shù)切除標(biāo)本均包含賁門癌原發(fā)灶及癌旁正常黏膜組織,腫瘤組織及癌旁組織均經(jīng)常規(guī)病理診斷證實(shí)。以上標(biāo)本一部分于-80℃凍存,用于RNA的提取;一部分以10%中性甲醛溶液固定,常規(guī)制作蠟塊保存,用于DNA的提取和免疫組織化學(xué)染色。1.2方法1.2.1tgfbr2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的檢測(cè)每個(gè)標(biāo)本均取10μm石蠟切片10～20片,經(jīng)常規(guī)蛋白酶K消化后,酚/氯仿抽提法提取賁門腺癌組織和癌旁正常組織的基因組DNA。每個(gè)樣本取5μgDNA,用2mol/LNaOH變性處理,于10mmol/L氫醌和3mol/L亞硫酸氫鈉中50℃反應(yīng)16h,然后用WizardDNA純化試劑盒純化經(jīng)亞硫酸氫鈉處理的DNA。經(jīng)亞硫酸氫鹽處理后,DNA中的C轉(zhuǎn)變?yōu)閁,而基因的CpG島若發(fā)生甲基化,則不能發(fā)生這種改變。根據(jù)此原理設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物,檢測(cè)該基因是否發(fā)生甲基化。用于檢測(cè)TGFBR2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的引物序列為5’-GAAAGTCGGTTAAAGTTTTCGGA-3’(上游引物)和5’-ACAAAACCTCTCTCCGCCCG-3’(下游引物),擬擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為119bp;用于檢測(cè)TGFBR2基因啟動(dòng)子區(qū)非甲基化的引物序列為5’-TTGAAAGTTGGTTAAAGTTTTTGGA-3’(上游引物)和5’-AAACAAAACCTCTCTCCACCCA-3’(下游引物),擬擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為123bp。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性10min后,94℃變性45s、53℃(甲基化擴(kuò)增)或55℃(非甲基化擴(kuò)增)退火45s、72℃延伸60s,35個(gè)循環(huán)后,72℃繼續(xù)延伸10min。MSP陽(yáng)性對(duì)照采用基因組DNA經(jīng)甲基化酶SssⅠ(NewEnglandBioLabs,Inc.,Beverly,MA)處理后進(jìn)行PCR,陰性對(duì)照用滅菌雙蒸水取代DNA模板進(jìn)行PCR。另外,為進(jìn)行MSP檢測(cè)的質(zhì)量控制,隨機(jī)選取10%標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳,用紫外線凝膠電泳成像及圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。1.2.2tgfbr2mrna的表達(dá)按TRIzol試劑說(shuō)明書提取腫瘤組織和癌旁正常組織的總RNA,并參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書的比例加樣,將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。TGFBR2的上游引物序列為5’-CAACATCAACCACAACACAGAG-3’,下游引物序列為5’-CCGTCTTCCGCTCCTCAG-3’,擬擴(kuò)增產(chǎn)物大小為248bp。GAPDH作為內(nèi)參照,其上游引物序列為5’-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3’,下游引物序列為5’-GTGGTCGTTGAGGGCAAT-3’,擬擴(kuò)增產(chǎn)物大小為342bp。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min后,94℃變性45s、54℃退火45s、72℃延伸60s,共30個(gè)循環(huán)后,72℃繼續(xù)延伸10min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳,采用Gelwork-2ID軟件對(duì)電泳圖像中TGFBR2mRNA表達(dá)水平進(jìn)行半定量分析。以TGFBR2條帶的光密度值與GAPDH條帶的光密度值的比值作為參數(shù),該值表示TGFBR2mRNA的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。1.2.3tgfbr2表達(dá)陽(yáng)性對(duì)照石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水,用含3%H2O2的甲醇溶液封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,微波修復(fù)15min。依次加入一抗(工作液稀釋比例為1︰100)及相應(yīng)的即用型生物素化二抗和即用型辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的三抗,DAB顯色,蘇木精對(duì)比染色細(xì)胞核,常規(guī)脫水,透明,中性樹膠封固。PBS取代一抗作為空白對(duì)照,其余步驟同上。選用正常胃黏膜組織作為TGFBR2表達(dá)的陽(yáng)性對(duì)照,乳腺癌組織作為TGF-β1表達(dá)的陽(yáng)性對(duì)照。隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(×400)計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞總數(shù)和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),得出陽(yáng)性細(xì)胞百分率,陽(yáng)性細(xì)胞率≤25%記為0分,26%～50%為1分,51%～75%為2分,>75%為3分;再按多數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)的染色強(qiáng)度予以記分,無(wú)顯色為0分,淺棕黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分。將上述2項(xiàng)得分相加,0分判為“-”,1～2分判為“+”,3～4分判為“++”,5～6分判為“+++”。由3名有經(jīng)驗(yàn)的臨床病理醫(yī)師閱片,根據(jù)其評(píng)分的平均值來(lái)確定判定結(jié)果。本研究進(jìn)行結(jié)果分析時(shí),以“++”和“+++”定義該蛋白為陽(yáng)性表達(dá),“-”和“+”定義為陰性表達(dá)。1.2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS軟件包(11.5版)進(jìn)行。計(jì)數(shù)資料采用χ2和校正χ2檢驗(yàn),計(jì)量資料采用t檢驗(yàn),相關(guān)性分析采用Spearman分析,為雙側(cè)檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1材料的甲基化率全部110例賁門腺癌組織及相應(yīng)癌旁組織均成功進(jìn)行了MSP分析(圖1示其中3例標(biāo)本的MSP分析結(jié)果,典型地反映出不同組織標(biāo)本中該基因的不同甲基化結(jié)果)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),110例賁門癌組織的TGFBR2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率為47.3%,而相應(yīng)癌旁正常黏膜組織有4例檢測(cè)到甲基化(占總例數(shù)的3.6%),癌組織的TGFBR2基因甲基化率顯著高于癌旁正常組織(P<0.01);按照TNM分期進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,Ⅲ期和Ⅳ期賁門癌患者中TGFBR2基因發(fā)生甲基化的比率顯著高于Ⅰ期和Ⅱ期患者(χ2=5.61,P=0.01);按照賁門癌的病理分級(jí)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,高、中、低分化的腫瘤組織發(fā)生甲基化的比率差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.69,P=0.02),見表1。2.2監(jiān)控結(jié)果分析mRNA表達(dá)情況RT-PCR法檢測(cè)了58例賁門腺癌組織及相應(yīng)的癌旁正常組織中TGFBR2mRNA的表達(dá)情況(圖2示其中6例標(biāo)本的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果)。檢測(cè)結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn),賁門腺癌組織中TGFBR2mRNA表達(dá)水平顯著低于相應(yīng)的癌旁正常組織(0.3879±0.1205vs0.8917±0.2765,P<0.01),且甲基化陽(yáng)性的賁門腺癌組織中TGFBR2mRNA表達(dá)水平顯著低于未發(fā)生甲基化的賁門腺癌組織(0.1745±0.0756vs0.5894±0.2061,P<0.01);TGFBR2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與其在mRNA水平上的表達(dá)缺失有明顯相關(guān)性(P<0.01)。2.3癌旁正常組織蛋白表達(dá)水平比較TGFBR2蛋白經(jīng)免疫組織化學(xué)染色呈現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)著色(圖3A～B)。檢測(cè)結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn),賁門腺癌組織中TGFBR2蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為20.9%(23/110),而相應(yīng)的癌旁正常組織中蛋白表達(dá)均呈陽(yáng)性,二者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);Ⅲ期和Ⅳ期賁門腺癌患者TGFBR2蛋白表達(dá)水平顯著低于Ⅰ期和Ⅱ期患者(χ2=5.03,P=0.02),而且隨程度的降低TGFBR2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率逐漸降低(χ2=6.46,P=0.04),見表1。發(fā)生TGFBR2基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化的52例腫瘤組織中有47例TGFBR2蛋白表達(dá)為陰性,TGFBR2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與其蛋白表達(dá)缺失有明顯的相關(guān)性(P<0.01,表2)。2.4tgf-1在材料表達(dá)情況TGF-β1蛋白經(jīng)免疫組織化學(xué)染色表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)著色(圖3C～D)。檢測(cè)結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn),賁門腺癌組織中TGF-β1蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為65.5%(72/110),而相應(yīng)的癌旁正常組織中蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為15.5%(17/110),二者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);Ⅲ期和Ⅳ期賁門腺癌患者的TGF-β1蛋白表達(dá)水平顯著高于Ⅰ期和Ⅱ期患者(χ2=4.19,P=0.04),且隨著腫瘤分化程度的降低,TGF-β1在賁門腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯升高(χ2=9.71,P<0.01),見表1。賁門腺癌中TGFBR1與TGF-β1的蛋白表達(dá)之間呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.71,P<0.05),而52例發(fā)生TGFBR2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的賁門腺癌組織中有45例TGF-β1蛋白表達(dá)陽(yáng)性,兩者呈明顯的相關(guān)性(r=0.76,P<0.01),見表3。3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路賁門癌在過(guò)去的腫瘤登記中經(jīng)常被當(dāng)做食管癌或胃癌,最近幾年由于內(nèi)鏡篩查和病理診斷技術(shù)的進(jìn)步,其已經(jīng)被獨(dú)立出來(lái)。流行病學(xué)調(diào)查顯示,20世紀(jì)80年代以來(lái),賁門癌的發(fā)病呈不斷上升趨勢(shì)。研究發(fā)現(xiàn),賁門癌的發(fā)病機(jī)制和臨床特征均與胃體腫瘤不同,而與食管癌相似,并且與食管癌的地域性分布也比較一致。但迄今為止,賁門癌發(fā)病的分子機(jī)制并不十分明確。TGF-β家族通過(guò)TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮重要的生物學(xué)效應(yīng),它調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、遷移、黏附以及細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生,在胚胎發(fā)育以及成人組織修復(fù)和免疫調(diào)節(jié)中行使重要作用,而且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展或浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移有關(guān)。TGF-β受體根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量大小可分為3類:Ⅰ型(相對(duì)分子質(zhì)量為5×104～6×104)、Ⅱ型(相對(duì)分子質(zhì)量為7.5×104～8.5×104)和Ⅲ型(相對(duì)分子質(zhì)量為2.8×105),它們都是跨膜的絲氨酸/蘇氨酸激酶。Ⅰ型受體和Ⅱ型受體是TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)所必需的,在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中,TGF-β首先與Ⅱ型受體結(jié)合成二元復(fù)合物,Ⅰ型受體識(shí)別此復(fù)合物并與之結(jié)合形成三元復(fù)合物;Ⅱ型受體的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域使Ⅰ型受體的GS結(jié)構(gòu)域中絲氨酸/蘇氨酸磷酸化,Ⅰ型受體被激活后進(jìn)一步作用于細(xì)胞內(nèi)的下游分子Smad,啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑;Ⅲ型受體是附屬受體,它本身不轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào),但能促進(jìn)TGF-β與Ⅱ型受體的結(jié)合。研究發(fā)現(xiàn),腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化在與TGF-β1抗增殖效應(yīng)敏感性的散失之間有一個(gè)很強(qiáng)的相關(guān)性,并且常常與TGF-β受體的表達(dá)水平降低或失活相聯(lián)系,因此TGF-β受體的缺失和突變是惡性腫瘤細(xì)胞逃避TGF-β生長(zhǎng)抑制效應(yīng)而引發(fā)腫瘤的機(jī)制之一。TGFBR2基因的突變可降低Ⅱ型受體在細(xì)胞膜上的表達(dá),當(dāng)Ⅱ型受體發(fā)生構(gòu)形改變時(shí),它與其他受體作用蛋白的相互作用會(huì)受到影響,與Ⅰ型受體結(jié)合也會(huì)受到影響,從而影響到與下游Smad蛋白的相互作用,導(dǎo)致Smad的磷酸化發(fā)生改變,進(jìn)一步影響到不同靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié),最終消除了TGF-β生長(zhǎng)抑制信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。已經(jīng)有報(bào)道,TGFBR2在多發(fā)性骨髓瘤、前列腺癌和肺癌中可發(fā)生基因的啟動(dòng)子區(qū)高甲基化,從而導(dǎo)致其失去活性;但其在賁門腺癌中的甲基化狀態(tài)研究報(bào)道較少。本課題組對(duì)TGF-β/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中關(guān)鍵基因及其影響因子如凝血酶敏感蛋白1(thrombospondin1,TSP1)的甲基化改變進(jìn)行了系列研究。本研究發(fā)現(xiàn),TGFBR2基因在賁門腺癌組織中可發(fā)生高頻率的甲基化(47.3%),并有相應(yīng)的蛋白表達(dá)缺失,提示由于TGFBR2基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生甲基化導(dǎo)致基因沉默,這可能是賁門腺癌中此基因失活的重要原因之一。本研究發(fā)現(xiàn),賁門腺癌組織中TGFBR2蛋白表達(dá)水平顯著低于癌旁正常組織,并與其甲基化狀態(tài)呈明顯的相關(guān)性,但發(fā)生甲基化的腫瘤組織中仍有5例蛋白表達(dá)呈陽(yáng)性。推測(cè)腫瘤組織中混雜有正常組織是其原因之一,但基因異質(zhì)性甲基化或一個(gè)等位基因發(fā)生甲基化也是一個(gè)重要的原因;而且本研究也發(fā)現(xiàn),蛋白表達(dá)呈陽(yáng)性而同時(shí)發(fā)生甲基化的組織中,其甲基化均表現(xiàn)為不完全甲基化。此外,有研究認(rèn)為CpG島甲基化的密度與基因轉(zhuǎn)錄的抑制程度有關(guān),弱的啟動(dòng)子能被密度較低的甲基化完全抑制,而當(dāng)啟動(dòng)子由增強(qiáng)子增強(qiáng)時(shí),即可恢復(fù)轉(zhuǎn)錄功能。因此,推測(cè)部分腫瘤組織可能由于TGFBR2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度不足以抑制轉(zhuǎn)錄而導(dǎo)致了發(fā)生甲基化的組織中TGFBR2蛋白表達(dá)仍可為陽(yáng)性。另外,本研究還發(fā)現(xiàn),未發(fā)生TGFBR2基因甲基化的賁門腺癌組織中其蛋白表達(dá)仍可呈陰性,究其原因,基因突變可能是導(dǎo)致蛋白表達(dá)水平降低的一個(gè)因素,而另一種表觀遺傳學(xué)改變即組蛋白乙?；赡芤才cTGFBR2的表達(dá)缺失有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn),組蛋白的乙酰化與TGFBR2在乳腺癌和肺癌中的表達(dá)缺失相關(guān),提示TGFBR2在腫瘤組織中的表達(dá)降低可