酶的分離純化

第四章酶的別離純化及產(chǎn)品成型〔1〕酶的抽提〔2〕酶的別離純化：沉淀別離、離心別離、膜過濾、層析別離、電泳別離〔3〕酶液的濃縮、結(jié)晶、枯燥、成型〔4〕酶純化過程的純度監(jiān)測(cè)本章知識(shí)點(diǎn)：.一、生物下游加工技術(shù)下游加工過程包括目標(biāo)產(chǎn)物的提取、濃縮、純化及成品化等過程。生物產(chǎn)物從原料〔培養(yǎng)液或細(xì)胞〕生產(chǎn)到產(chǎn)品的后處理技術(shù)〔別離純化技術(shù)〕的開展，使低本錢、高收率地純化目標(biāo)產(chǎn)物成為現(xiàn)實(shí)。大多數(shù)酶的回收純化過程本錢約占70%；醫(yī)用酶的生產(chǎn)回收過程的本錢高達(dá)85%；基因工程表達(dá)產(chǎn)物的回收純化過程本錢一般占85-90%以上；青霉素回收過程本錢約占50%；乙醇的回收過程本錢僅占14%。.二、別離純化的一般流程原料液細(xì)胞別離〔離心、過濾〕細(xì)胞〔胞內(nèi)產(chǎn)物〕清液〔胞外產(chǎn)物〕細(xì)胞破碎碎片別離粗別離純化成品化線路2線路1.人干擾素、是一種重要蛋白類生物藥品，具有抗癌和治療肝炎等作用。Yonehara等人：醋酸鋅鹽析離子交換層析硫酸銨鹽析銅螯合層析疏水層析凝膠電泳staehelin等人：硫酸銨鹽析免疫親和層析陽離子交換層析〔83.0%〕〔62.7%〕〔96.2%〕〔46.0%〕〔78.3%〕〔88.9%〕共六步，總收率僅為16%僅三步，總收率達(dá)81.0%.在實(shí)踐工作中選擇方法時(shí):首先，應(yīng)對(duì)被純化的酶的理化性質(zhì)有—個(gè)比較全面的了解;其次，判斷采用的方法和條件是否得當(dāng)，始終以測(cè)定酶活性為標(biāo)準(zhǔn)。再者，在純化工作中，往往不宜重復(fù)采用相同的步驟和條件。最后，要嚴(yán)格控制操作條件。隨著酶的逐步純潔，雜蛋白含量亦逐步降低，蛋白質(zhì)之間的相互作用力隨之下降,酶更不穩(wěn)定，因此,更要防止酶變性。.三、酶別離純化的根本原那么〔一〕酶別離純化包括三個(gè)根本環(huán)節(jié)抽提純化精制〔二〕酶別離純化應(yīng)注意以下問題1、防止酶變性失活：溫度、pH、泡沫、重金屬等。2、選擇有效的純化方法。3、酶活性測(cè)定與總蛋白質(zhì)含量測(cè)定應(yīng)貫穿純化過程的始終。..第一節(jié)從發(fā)酵液制取酶提取液〔酶溶液的制備〕一、發(fā)酵液的預(yù)處理目的：降低粘度，便于固液別離方法：〔1〕加熱：適用于耐熱的酶，注意常要加適當(dāng)?shù)拿副Ｗo(hù)劑?！?〕加凝聚劑或絮凝劑〔3〕調(diào)pH值二、固液別離方法：〔1〕離心別離；〔2〕過濾；〔3〕雙水相萃取.三、細(xì)胞破碎機(jī)械破碎法物理破碎法化學(xué)破碎法：甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有機(jī)溶劑和Triton、Tween等外表活性劑酶促破碎法搗碎法：搗碎機(jī)研磨法：研缽、細(xì)菌磨、石磨、球磨等勻漿法：勻漿器溫度差破碎法：凍融交替法壓力差破碎法：高壓沖擊法、突然降壓法、滲透壓變化法超聲波破碎法自溶法加酶處理G+菌：溶菌酶G-菌：溶菌酶、巰基乙醇等酵母菌：β-葡聚糖酶和溶菌酶霉菌：幾丁質(zhì)酶.四、抽提〔一〕抽提方法指在一定的條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┨幚砗冈?，使酶充分溶解到溶劑中的過程，也稱為酶的提取。四稀：稀酸、稀堿、稀鹽、稀有機(jī)溶劑〔二〕抽提過程中的本卷須知1、pH值：選擇的pH值不超出酶的酸堿穩(wěn)定范圍；最好遠(yuǎn)離待抽提酶的等電點(diǎn)。2、溫度：通常控制在0~4℃左右，尤其是采用有機(jī)溶劑提取時(shí)。3、抽提液體積〔用量〕

抽提液的用量一般為含酶原料體積的2~5倍?？梢淮纬樘幔部煞謳状畏磸?fù)抽提。4、為提高酶的穩(wěn)定性，可以參加適量的保護(hù)劑。.分離依據(jù)的性質(zhì)分離方法根據(jù)分大小、輕重離心分離、凝膠過濾、膜分離根據(jù)溶解度大小鹽析沉淀、有機(jī)溶劑沉淀、共沉淀、選擇性沉淀、等電點(diǎn)沉淀根據(jù)電學(xué)性質(zhì)離子交換層析、電泳分離根據(jù)穩(wěn)定性差異選擇性熱變性法、選擇性酸堿變性法、選擇性表面變性法根據(jù)親和作用親和層析、親和電泳酶別離純化方法：現(xiàn)有的純化方法，都是以酶與雜蛋白在理化性質(zhì)、穩(wěn)定性上的差異以及酶的生物學(xué)特性為依據(jù)而建立起來的。.第三節(jié)酶的沉淀別離鹽析沉淀法√、等電點(diǎn)沉淀法、有機(jī)溶劑沉淀法、復(fù)合沉淀法一、鹽析沉淀法1、原理：2、硫酸銨鹽析的優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：①在水中溶解度大，溶解的溫度系數(shù)小；②價(jià)廉，廉價(jià)；③可保護(hù)酶。缺點(diǎn)：溶解過程隨濃度增加的體積變化是非線性的變化。.3、鹽析操作〔1〕硫酸銨的飽和度×100%（NH4）2SO4的飽和度（%）=實(shí)際濃度飽和濃度0.4S=40%〔飽和度〕.〔2〕調(diào)整鹽濃度的方法加飽和〔NH4〕2SO4溶液：VV0（S2-S1）1-S2=V0—原來溶液的體積V—所需加入飽和硫酸銨的體積S1—原來溶液的硫酸銨飽和度S2—所需達(dá)到的硫酸銨飽和度例：將2升0.2S的硫酸銨溶液提升至0.5S，需加飽和硫酸銨多少升？溶液體積增加多少倍？.加固體〔NH4〕2SO4：WB（S2-S1）1－AS2=W—將1L飽和度為S1的溶液提高到S2所要添加的固體硫酸銨克數(shù)；A、B—與溫度有關(guān)的經(jīng)驗(yàn)常數(shù)例：某酶制劑廠生產(chǎn)15噸蛋白酶發(fā)酵液，用硫酸銨進(jìn)行鹽析,要求硫酸銨的飽和度到達(dá)40%，計(jì)算需要參加固體硫酸銨多少kg?〔25℃〕經(jīng)驗(yàn)常數(shù)0℃10℃20℃25℃30℃A0.2710.2810.2900.2940.298B（g/L）514.72525.05536.34541.24545.88（mol/L）3.093.974.064.104.133680Kg.(25℃).當(dāng)溶液體積不大，要到達(dá)的鹽濃度不高，可以參加飽和硫酸銨溶液；當(dāng)溶液體積較大，要到達(dá)的鹽濃度又較高，此時(shí)參加固體硫酸銨較好。4、為了得到較好的鹽析效果，應(yīng)控制以下因素〔1〕不同酶，鹽析時(shí)所需的鹽濃度各不相同。實(shí)際料液中目標(biāo)酶的鹽析沉淀操作前，所需的硫酸銨濃度或飽和度可通過實(shí)驗(yàn)確定?！?〕加鹽操作時(shí)，防止局部鹽濃度過高，防止產(chǎn)生泡沫。〔3〕pH值和溫度：等電點(diǎn)附近，室溫或低溫操作?！?〕脫鹽：超濾、透析或?qū)游??！?〕蛋白質(zhì)濃度：樣品液的蛋白質(zhì)濃度一般控制在2.5~3.0%為宜，太濃時(shí)應(yīng)適當(dāng)稀釋，以減少雜蛋白共沉淀。..〔二〕等電點(diǎn)沉淀1、原理2、實(shí)際操作與其他方法一起使用〔鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、復(fù)合沉淀〕。單獨(dú)使用時(shí)，主要是用于從粗酶中除去某些等電點(diǎn)相距較大的雜蛋白。3、注意加酸堿調(diào)節(jié)pH值時(shí)，防止局部酸堿過高。.〔三〕有機(jī)溶劑沉淀法1、作用原理去水膜；降低介電常數(shù)、破壞氫鍵。2、注意低沸點(diǎn)，易燃易爆；低溫操作，沉淀析出后要盡快別離。.〔四〕復(fù)合物沉淀法1、原理2、常用的復(fù)合沉淀劑：?jiǎn)螌?、聚乙二醇、聚丙烯酸等高分子聚合物。PAA+酶PAA-酶PAA-酶PAA+酶

PAA+酶+Ca2+PAA-Ca2++酶

PAA-Ca2++SO4

2-CaSO4+PAApH6以上.〔五〕選擇性變性沉淀法1、熱變性法：根據(jù)目的酶與雜蛋白熱穩(wěn)定性差異，可以在較高溫度下，使雜蛋白變性沉淀，而酶那么保持可溶狀態(tài)。2、酸堿變性法：與熱變性原理類似，目的酶與雜蛋白的酸堿穩(wěn)定性不同，可以調(diào)整不同的pH使雜蛋白變性沉淀。選擇一定的條件使酶液中存在的某些蛋白質(zhì)等雜質(zhì)變性沉淀，而不影響所需的酶。.借助于一定孔徑的高分子薄膜，將不同大小、不同形狀和不同特性的物質(zhì)顆?；蚍肿舆M(jìn)行別離、提純或濃縮的新型別離技術(shù)。第三節(jié)膜過濾技術(shù)在酶別離純化中的應(yīng)用膜別離技術(shù)已被國(guó)際上公認(rèn)為20世紀(jì)末至21世紀(jì)中期最有開展前途，甚至?xí)?dǎo)致一次工業(yè)革命的重大生產(chǎn)技術(shù)，所以可以稱為前沿技術(shù)，是世界各國(guó)研究的熱點(diǎn)。廣泛應(yīng)用于生物工程、化學(xué)、制藥、飲料、電力、冶金、海水淡化、資源再生等領(lǐng)域。滲出液.一、膜別離的類型1、按推動(dòng)力不同可分為：〔1〕擴(kuò)散膜別離：滲透、透析〔2〕壓力差膜別離：微濾、超濾、納濾、反滲透〔3〕電位差膜別離：電滲析2、按膜孔徑或截留物質(zhì)的大?。何V——超濾——納濾、電滲析、透析——反滲透膜孔徑大小.病毒生物大分子生物小分子鹽類水灰塵細(xì)菌病毒生物大分子生物小分子鹽類水灰塵細(xì)菌病毒生物大分子生物小分子鹽類水灰塵細(xì)菌病毒生物大分子生物小分子鹽類水膜微濾〔MF〕超濾〔UF〕納濾〔MF〕反滲透濾〔RO〕灰塵細(xì)菌〔0.2-2um〕〔10-200nm〕〔＜2nm〕〔2-10nm〕.各種膜別離法的原理和應(yīng)用范圍膜分離法截留的顆粒大小截留的主要物質(zhì)過濾介質(zhì)應(yīng)用舉例微濾（MF）0.2~2um灰塵、細(xì)菌微孔濾膜除菌，回收菌超濾（UF）10nm~200nm生物大分子及以上超濾膜蛋白質(zhì)、多肽和多糖的回收和濃縮納濾（NF）2nm~10nm生物小分子及以上納濾膜脫鹽、濃縮反滲透（RO）<2nm鹽類及以上反滲透膜鹽、氨基酸、糖的濃縮、淡水制造.〔一〕微濾(MF)又稱微孔過濾，是以微濾膜作為過濾介質(zhì)的膜別離技術(shù)?！?〕截留顆粒直徑：0.2~2um。〔2〕操作壓力：低于0.1MPa。〔3〕應(yīng)用：實(shí)驗(yàn)室和生產(chǎn)中通常利用微濾技術(shù)除去或收集酶發(fā)酵液中的細(xì)胞。無菌水、礦泉水、純生啤酒的生產(chǎn)。熱敏性藥物和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的過濾除菌等二、酶別離純化中幾種常見的膜別離技術(shù).〔二〕超濾(UF)可截留溶液中溶解的大分子物質(zhì)，而透過小分子物質(zhì)?！?〕截留顆粒直徑：10~200nm?！?〕操作壓力：0.1~0.7MPa?！?〕應(yīng)用：一是別離純化，從高分子物質(zhì)與低分子物質(zhì)的溶液中，使低分子物質(zhì)透過膜；二是溶液的濃縮。.〔三〕反滲透(RO)在壓力作用下，溶劑〔通常是水〕透過膜，而溶質(zhì)被阻擋于膜壁外。〔1〕截留顆粒直徑：小于2nm?！?〕操作壓力：1~8MPa?！?〕應(yīng)用：主要用于別離各種離子和小分子物質(zhì)。在酶液的濃縮、無離子水的制備、海水淡化等方面廣泛應(yīng)用。溶質(zhì)水水膜溶質(zhì)水水膜滲透反滲透.〔四〕電滲析在電場(chǎng)作用下，帶電離子透過膜向兩極移動(dòng)，而到達(dá)別離的目的。酶液膜膜+-+-應(yīng)用：電滲析主要用于酶液或其他溶液的脫鹽、海水淡化、純水制備等.透析袋酶溶液蒸餾水應(yīng)用：在生物別離方面，主要用于生物大分子溶液的脫鹽。由于透析過程以濃差為傳質(zhì)推動(dòng)力，膜的透過通量很小，不適于大規(guī)模生物別離過程，而在實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用較多?！参濉惩肝鳆}類水膜透析水膜滲透.三、膜別離技術(shù)的根本流程滲出液膜組件料液罐濃縮液（回流液）泵.中空纖維超濾器中空纖維膜別離裝置是將成束的中空纖維裝入一筒內(nèi)，兩端封閉。當(dāng)軸流通過管腔時(shí)，造成高剪切力，在截留溶質(zhì)分子的同時(shí)，將濃度降至最低限度。每根中空纖維內(nèi)腔直徑為0.2mm,中空纖維由惰性的非離子聚合物制成．具有各向異性、抗堵塞性，運(yùn)用成束纖維外表積大，流量大、阻留溶質(zhì)的濃度范圍(4％一20％左右)如右圖。四、生產(chǎn)中常用的膜別離裝置.中空纖維超濾膜組件.清洗液清洗液出口滲出液滲出液（c）.......五、膜及膜的使用性能〔一〕、膜的結(jié)構(gòu)和制膜材料膜表層：孔徑各異，厚度為0.1~5um基層：起支持作用，厚度為50~250um制膜材料：醋酸纖維素、硝酸纖維素、聚砜、聚酰胺等〔二〕、膜的使用性能〔1〕透水率〔透水通量、流率〕；〔2〕截留率；〔3〕截留物相對(duì)分子質(zhì)量.生物別離過程常用的膜別離技術(shù)為超濾、微濾和反滲透。為實(shí)現(xiàn)高效率的膜別離操作，對(duì)膜材料有如下要求：(1)起過濾作用的有效膜厚度小，超濾和微濾膜的開孔率高，過濾阻力??；(2)膜材料為惰性，不吸附溶質(zhì)(蛋白質(zhì)、細(xì)胞等)，從而使膜不易污染，膜孔不易堵塞；(3)適用的pH和溫度范圍廣，耐高溫火茵，耐酸堿清洗劑，穩(wěn)定性高，使用壽命長(zhǎng)；(4)容易通過清洗恢復(fù)透過性能；(5)滿足實(shí)現(xiàn)別離目的的各種要求，如對(duì)菌體細(xì)胞的截留、對(duì)生物大分子的通透性或截留作用等。目前市售膜的種類很多，主要有天然高分子、合成高分子和無機(jī)材料。下面簡(jiǎn)要介紹制造超濾、微濾和反滲透膜的各種膜材料。膜材料.1.天然高分子材料主要是纖維素的衍生物，有醋酸纖維、硝酸纖維和再生纖維素等。其中醋酸纖維膜的截鹽能力強(qiáng)，常用作反滲透膜、也可用作微濾膜和超濾膜。醋酸纖維膜使用最高溫度和pH范圍有限，一般使用溫度低于45～50℃，pH3～8。再生纖維素可制造透析膜和微濾膜。2.合成高分子材料市售膜的大局部為合成高分子膜，種類很多，主要有聚砜、聚丙烯晴、聚酰亞胺、聚酰胺、聚烯類和含氟聚合物等。其中聚砜是最常用的膜材料之一，主要用于制造超濾脂。聚砜膜的特點(diǎn)是耐高溫(一般為70～80℃，有些可高達(dá)125度)，適用pH范圍廣(pH1～13)，耐氯能力強(qiáng)，可調(diào)節(jié)孔徑范圍寬(1～20nm)。但聚砜膜耐壓能力較低，一般平板膜的操作力極限為0.5～1.0MPa。聚酰胺膜的耐壓能力較高，對(duì)溫度和pH都有很好的穩(wěn)定性，使用壽命較長(zhǎng)，常用于反滲透。.3無機(jī)材料主要有陶瓷、微孔玻璃、不銹鋼和碳素等。目前實(shí)用化的無機(jī)膜主要有孔徑0.1μm以上的微濾膜和截留相對(duì)分子質(zhì)量l0kD以上的超濾膜，其中以陶瓷材料的微濾膜最為常用。多孔陶瓷膜主要利用氧化鋁、硅膠、氧化鋯和鈦等陶瓷微粒燒結(jié)而成，膜厚方向不對(duì)稱。無機(jī)膜的特點(diǎn)是機(jī)械強(qiáng)度高，耐高溫、耐化學(xué)試劑和耐有機(jī)溶劑，但缺點(diǎn)是不易加工，造價(jià)較高。另一類無機(jī)微濾膜為動(dòng)態(tài)膜(dynamicmembrane)，是將含水金屬氧化物(如氧化鋯)等膠體微粒或聚丙烯酸等沉積在陶瓷管等多孔介質(zhì)外表形成的膜，其中沉積層起篩分作用。動(dòng)態(tài)膜的特點(diǎn)是透過通量大，通過改變pH值容易形成或除去沉積層，因此清洗比較容易，但缺點(diǎn)是穩(wěn)定性較差。.1、假設(shè)除去酶溶液中的鹽分，可采用下面哪種別離方式？〔〕A、板框過濾B、微濾C、超濾D、反滲透2、假設(shè)要?jiǎng)e離除去酶溶液中的生物小分子，可采用下面哪種別離方式？〔〕A、板框過濾B、微濾C、超濾D、反滲透練習(xí)：.第四節(jié)離心技術(shù)在酶別離純化中的應(yīng)用離心是借助于離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小和不同密度的物質(zhì)分開的技術(shù)?！惨弧掣驹黼x心力：Fc=mac=mω2r

rminrmeanrmax軸心離心管式中：Fc—離心力；m—為物質(zhì)質(zhì)量(g)；ac—為離心加速度(m/s2)；r—離心管中受力粒子到離心機(jī)軸心的垂直距.相對(duì)離心力：=11.18×10-6n2r〔g〕〔r取厘米，g為980厘米/秒2〕工業(yè)上稱相對(duì)離心力為離心別離因素，r取米，那么：RCF=1900n2r〔g〕.〔二〕離心機(jī)分類低速離心機(jī)：＜8000r/min高速離心機(jī)：8000~25000r/min超速離心機(jī)：＞100000r/min冷凍系統(tǒng)、離心管帽冷凍系統(tǒng)、離心管帽、真空系統(tǒng).料液輕相重相工業(yè)用碟片式離心機(jī).〔三〕離心方法1、差速離心采用不同的離心速度和離心時(shí)間，使不同沉降的顆粒先后別離的方法。2、密度梯度離心在離心管中用5~60%的蔗糖溶液，形成由管底到液面逐漸降低的梯度，將樣品放在密度梯度溶液的外表，經(jīng)過離心，不同大小、具有一定沉降系數(shù)差異的顆粒在密度梯度溶液中形成假設(shè)干條不連續(xù)的區(qū)帶。3、等密度梯度離心當(dāng)欲別離的不同顆粒的密度范圍處于離心介質(zhì)的密度范圍時(shí)，在離心力的作用下，不同浮力密度的顆粒一直移動(dòng)到與他們各自的浮力密度恰好相等的位置，形成區(qū)帶。.〔四〕離心沉降速度和沉降系數(shù)沉降速度〔v〕：離心管中的粒子在離心力場(chǎng)作用下，向垂直于轉(zhuǎn)軸方向移動(dòng)的速度。v

=drdt=S·ω2rS=dr/dtω2rS為沉降系數(shù)，單位：秒許多大分子和超分子復(fù)合物〔如核糖體等〕的沉降系數(shù)，都在10-13秒這個(gè)數(shù)量級(jí)，將定為1S.〔五〕離心時(shí)間離心時(shí)間:1dt=

ω2Sdrr·t2–t1=1ω2S（lnr2-lnr1）積分得：根據(jù)所用的離心機(jī)，確定了沉降開始的離心半徑r1和預(yù)定終止的r2，又確定了離心時(shí)的轉(zhuǎn)速，對(duì)某一具體的顆粒，其沉降系數(shù)S也是定值，就可計(jì)算出離心所需時(shí)間〔t2-t1〕.作業(yè)題：1、在25℃下，將800L含硫酸銨為0.2S的溶液提高到0.5S，需要加飽和硫酸銨溶液多少升？或者加固體硫酸銨多少公斤？2、實(shí)驗(yàn)室臺(tái)式離心機(jī)轉(zhuǎn)速為4000r/min，離心半徑5cm，RCF為多少？工業(yè)離心機(jī)同樣轉(zhuǎn)速，離心半徑為0.3m，離心別離因素是多少？.第六節(jié)層析(色譜)技術(shù)在酶別離純化中的應(yīng)用.一、色譜別離法色譜法是1905年俄國(guó)植物學(xué)家茨維特創(chuàng)造的。他將植物色素的石油醚提取液倒入一根裝有碳酸鈣的玻璃管頂端，用石油醚淋洗玻璃管，使色素出現(xiàn)別離，在管內(nèi)顯示出不同的色帶，色譜一詞由此得名。碳酸鈣〔固定相〕石油醚〔流動(dòng)相〕色譜柱.二、色譜法分類1、根據(jù)流動(dòng)相狀態(tài)不同分液相色譜氣相色譜常壓液相色譜

√高壓液相色譜2、根據(jù)分離介質(zhì)不同分柱色譜√紙色譜薄層色譜毛細(xì)管色譜.3、根據(jù)別離原理不同分吸附層析分配層析離子交換層析凝膠過濾層析親和層析√√√.三、層析別離的原理混合液中各組分的理化性質(zhì)〔分子大小、吸附力、親和力、帶電等〕不同，固定相對(duì)不同組分的作用力(方式,大小等)不同，隨著流動(dòng)相相對(duì)于固定相運(yùn)動(dòng),各組分在固定相上移動(dòng)速度不同,從而彼此別離開來。.四、根本操作過程(柱層析)層析柱的準(zhǔn)備固定相材料的準(zhǔn)備裝柱平衡上樣〔洗滌和〕洗脫收集洗脫液洗脫液檢測(cè)，繪制洗脫曲線〔柱再生〕下一輪上樣.1、層析柱：材料：玻璃或有機(jī)玻璃、鋼管。高徑比〔H/D〕：100~150:1~202、固定相材料準(zhǔn)備

篩選顆粒大小一致的組分→浸泡吸脹→淘洗去小顆粒吸附劑：篩選→高溫處理活化或酸堿處理去金屬離子。離子交換劑：HCl或NaOH交換處理，離子交換樹脂用2~3倍于樹脂體積的2mol/L，離子交換纖維素用0.5mol/L酸、堿處理。.3、裝柱與平衡

垂直固定柱，然后干法或濕法裝柱，再用2~3倍體積的上樣緩沖液過柱，使柱床的離子強(qiáng)度與上樣液一致，即所謂平衡。4、上樣〔加樣〕將樣品細(xì)心加到柱床頂面，切勿沖動(dòng)床面。5、〔洗滌〕洗脫、收集和分析洗滌是親和層析的獨(dú)特步驟，是用上樣緩沖液過柱，將未被親和吸附劑吸附的雜質(zhì)淋洗出柱床的操作。.五、幾種層析別離方法〔一〕吸附層析利用物理吸附劑對(duì)不同物質(zhì)吸附能力的不同而使混合液中各組分別離的方法。1、原理2、吸附劑的種類和特點(diǎn)〔1〕種類：活性氧化鋁、硅膠、硅藻土、碳酸鹽、活性碳、陶土、纖維素等。.〔2〕特點(diǎn)：①來源豐富、價(jià)廉、可再生、吸附設(shè)備簡(jiǎn)單。②有些吸附劑使用前要預(yù)處理，以除去雜質(zhì)，提高吸附力，增強(qiáng)別離效果。③上樣時(shí)低pH值和低離子強(qiáng)度，半小時(shí)后提高pH值和離子強(qiáng)度洗脫。3、吸附的三個(gè)根本環(huán)節(jié)：加樣、吸附、洗滌或洗脫。.4、洗脫方法：〔1〕溶劑洗脫法：〔2〕置換洗脫法：〔3〕前緣洗脫法：.〔二〕離子交換層析1、原理利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)〔活性基團(tuán)〕對(duì)各種離子親和力不同而到達(dá)別離目的的一種別離方法。2、離子交換劑〔1〕根據(jù)母體不同可分為離子交換樹脂：交換容量不大，易使酶失活離子交換纖維素：最廣泛的一類離子交換凝膠：不耐高流速洗脫.根據(jù)活性基團(tuán)性質(zhì)不同可分為陽離子交換劑：能吸附帶“+〞的離子或酶-CM-〔羧甲基〕、-PO32-〔磷酸基〕、-SO3-〔磺酸基〕陰離子交換劑：能吸附帶“-〞的離子或酶-DEAE〔二乙基氨基乙基〕、-TEAE〔三乙基氨基乙基〕3、離子交換反響蛋白質(zhì)/酶在不同的pH條件下，將發(fā)生不同的離解作用，而帶不同的電荷，選擇相應(yīng)的離子交換劑。.4、操作要點(diǎn)〔1〕裝柱：濕法裝柱，離子交換劑上樣前抽氣泡。〔2〕加樣、平衡：1%~5%上樣量?！?〕洗脫、收集：梯級(jí)洗脫〔分時(shí)段改變洗脫液的pH或鹽離子強(qiáng)度〕、梯度洗脫〔連續(xù)改變pH或鹽離子強(qiáng)度〕?！?〕再生：離子交換劑要再生，和預(yù)處理程序相同。..練習(xí)1、下面哪一種不能作為離子交換劑用于別離純化酶？〔〕A、DEAE-SephadexB、CM-纖維素C、TEAE-SepharoseD、SephadexG502、某酶的等電點(diǎn)為6.8，假設(shè)采用DEAE-纖維素進(jìn)行離子交換別離，可選擇下面哪種pH的緩沖液上柱？〔〕A、pH為5.0的緩沖液B、pH為6.8的緩沖液C、pH為8.0的緩沖液D、都不行.〔三)凝膠過濾層析gelfiltrationchromatography1、原理利用各組分分子量大小不同，從而在凝膠網(wǎng)孔中流速不同到達(dá)別離的目的。2、常用的凝膠種類（1）葡聚糖凝膠

SephadexG-X

X—表示每克干膠的吸水值的10倍吸水值越大，分子量范圍越寬.〔2〕瓊脂糖糖凝膠Sepharose2B、4B、6B2B、4B、6B表示瓊脂糖含量為2%、4%、6%，濃度越高，凝膠網(wǎng)眼孔徑越小，分布的大分子相對(duì)分子質(zhì)量越小，范圍越窄?！?〕聚丙烯酰胺糖凝膠Bio-GelP-2、4、6、…….、200、300，共10種型號(hào)。P后的數(shù)字表示別離的最大相對(duì)分子質(zhì)量〔×103〕。..3、操作要點(diǎn)〔1〕、裝柱前要吸脹和抽氣。常溫吸脹需較長(zhǎng)時(shí)間，可加熱溶脹。〔2〕、加樣量不超過3%。〔3〕、洗脫液應(yīng)與平衡時(shí)的溶液一致?！?〕、無須經(jīng)過再生處理?！?〕、長(zhǎng)期不用時(shí)，可加0.02%的NaN3保存。..4、凝膠層析測(cè)定蛋白質(zhì)〔酶〕的相對(duì)分子質(zhì)量不同分子之間的別離，是它們?cè)趦?nèi)水和外水之間的一種分配行為，流出柱的先后，用分配系數(shù)Ka作定量描述：Ka=〔Ve-Vo〕/ViVe——洗脫體積，指從洗脫開始到某一組分流出峰值時(shí)所用洗脫液體積Vo——外水體積，柱床中凝膠顆粒之間的空隙體積Vi——內(nèi)水體積，凝膠顆粒內(nèi)部空隙體積的總和當(dāng)Ka=0時(shí)，Ve=Vo，全排出的大分子當(dāng)Ka=1時(shí)，Ve=Vo+Vi，是全受阻的小分子或無機(jī)離子Ka=0~1時(shí)，其他大小介于兩者之間的分子.Ve——洗脫體積，指從洗脫開始到某一組分流出峰值時(shí)所用洗脫液體積Vo——外水體積，柱床中凝膠顆粒之間的空隙體積Vi——內(nèi)水體積，凝膠顆粒內(nèi)部空隙體積的總和Ka值最小的，最先流出；Ka值最大的，最后流出。同一個(gè)凝膠床，內(nèi)水體積和外水體積〔Vo和Vi〕為定值，因而洗脫體積〔Ve〕小的，就是相對(duì)分子質(zhì)量大的。Ka

=Ve-VoVi.Ve

=-K2lgMr+K1Mr——相對(duì)分子質(zhì)量蛋白質(zhì)分子量與凝膠層析洗脫體積的關(guān)系VelgMr····用一組相對(duì)分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，作出上圖，然后對(duì)未知相對(duì)分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)〔酶〕在同一凝膠柱上實(shí)驗(yàn)，測(cè)得Ve，就可以查標(biāo)準(zhǔn)曲線算出它的相對(duì)分子質(zhì)量。.練習(xí)下面哪一種不能用于凝膠過濾別離純化酶？〔〕A、SephadexB、PEGC、SepharoseD、PAG.〔四)親和層析1、原理

生物分子對(duì)間的專一而又可逆的結(jié)合力，稱為親和力，利用這種親和專一性的特點(diǎn)，而制備專門的親和吸附劑，用其進(jìn)行蛋白質(zhì)等生物分子的層析純化，就是親和層析，效率特別高。2、親和吸附劑由母體與配基偶聯(lián)而成。配基：作為固定相的分子對(duì)的一方。母體：又稱載體，如各種凝膠、纖維素均是惰性物，須先活化后再與配基反響。.3、操作要點(diǎn)(1)要先洗滌后洗脫,用含有與親和吸附劑相同的高濃度配基或另一種配基洗脫?！?〕柱床要再生10倍于柱床體積的0.1mol/LNaCl-0.1mol/LTris-HCl洗至PH8.5,改用0.5mol/LNaCl-0.1mol/LHAC洗至pH4.5,然后用純水洗至中性..4、親和層析方法〔1〕共價(jià)親和層析〔2〕疏水層析〔3〕金屬離子親和層析〔4〕免疫親和層析〔5〕染料親和層析〔6〕凝集素親和層析.吸附層析離子交換層析凝膠層析親和層析固定相支持物物理吸附劑，如活性氧化鋁磷酸鈣膠體等離子交換凝膠離子交換纖維素離子交換樹脂葡聚糖凝膠瓊脂糖凝膠聚丙烯酰胺凝膠（凝膠網(wǎng)孔內(nèi)水為固定相）用瓊脂糖或纖維素為載體共價(jià)結(jié)合適當(dāng)?shù)呐浠捎H和吸附劑操作步驟特殊點(diǎn)無纖維素和凝膠類交換劑裝柱時(shí)先抽氣，柱床要再生后再上樣濕凝膠抽氣后濕法裝柱上樣后先洗滌除雜質(zhì)然后洗脫，柱床要再生洗脫特點(diǎn)洗脫液離子強(qiáng)度比樣品液高常用pH梯度或鹽濃度梯度洗脫用樣品和平衡緩沖液洗脫洗脫液含酶的配基或其他物質(zhì)應(yīng)用酶分離純化成本較低離子交換纖維素洗脫條件較溫和，酶分離純化多用廣泛用于酶分離純化、脫鹽、測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量酶純化效率高，但制備親和吸附劑較麻煩，貴.第六節(jié)電泳技術(shù)在酶別離純化中的應(yīng)用.電泳的定義帶電顆粒在電場(chǎng)的作用下，向著與其電性相反的電極方向移動(dòng)，這種現(xiàn)象稱之為電泳(electrophoresis，簡(jiǎn)稱EP)。電泳技術(shù)就是根據(jù)各種帶電粒子在電場(chǎng)中遷移速度的不同而對(duì)物質(zhì)進(jìn)行別離的一類實(shí)驗(yàn)技術(shù)。電泳開展:電泳現(xiàn)象早在1808年就已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，但電泳作為一種別離技術(shù)卻是在1937年由瑞典科學(xué)家TiseliusA首先提出來的，并設(shè)計(jì)出世界上第一臺(tái)自由電泳儀，建立了“移界電泳〞別離模式。他用光學(xué)方法觀察到在電泳遷移過程中血清蛋白質(zhì)界面的移動(dòng)，首先證明了血清是由白蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白組成的，為表彰他對(duì)電泳技術(shù)所做出的突出奉獻(xiàn)，1948年他被授予諾貝爾獎(jiǎng)。.帶電粒子在電場(chǎng)中遷移的速度：A、α—常數(shù)r—粒子的半徑Q—粒子的外表電荷量η—介質(zhì)的粘度E—電場(chǎng)強(qiáng)度μ—介質(zhì)的離子強(qiáng)度一、電泳的根本原理.此式說明：影響電泳時(shí)帶電粒子遷移速度的因素，包括：〔1〕電場(chǎng)強(qiáng)度〔電壓〕〔2〕帶電粒子外表電荷〔3〕帶電粒子大小〔4〕介質(zhì)的粘度〔5〕溶液的離子強(qiáng)度〔6〕電滲的影響，公式中沒有反映，主要在紙電泳時(shí)表現(xiàn)較明顯。.在一定的電泳條件下，E〔V〕、η、μ為定值，對(duì)于酶等兩性大分子來說，電泳時(shí)的遷移速度，主要取決于分子的外表電荷多少和分子大小，因此，不同的分子可以由Q和r不同而彼此別離。蛋白質(zhì)〔酶〕的電荷性質(zhì)和電荷量，取決于它們的PI與溶液的pH值的關(guān)系。.1、聚丙烯酰胺凝膠〔PAG〕PAG由丙烯酰胺〔arc，單體〕和甲叉雙丙烯酰胺〔bis，雙體，交聯(lián)劑〕在催化劑作用下聚合而成。arc濃度：凝膠的孔徑大小arc和bis的比例：凝膠的強(qiáng)度催化劑用量：聚合時(shí)間二、聚丙烯酰胺凝膠電泳〔PAGE〕.2、PAGE的應(yīng)用類型常規(guī)PAGE濃度梯度PAGESDS不連續(xù)PAGE〔用于一般分析別離純化〕連續(xù)PAGE〔同上〕〔用于測(cè)定Pr相對(duì)分子質(zhì)量和別離純化〕〔用于測(cè)定Pr單體相對(duì)分子質(zhì)量和雙向電泳〕.3、不連續(xù)PAGE的特性和別離Pr的效應(yīng)〔1〕三個(gè)不連續(xù)凝膠濃度不連續(xù)；pH值不連續(xù)；緩沖液不連續(xù)。〔2〕三種效應(yīng)濃縮效應(yīng)；電荷效應(yīng)；分子篩效應(yīng)。..4、濃度梯度PAGE

配制4%和30%的別離膠，在梯度混合儀制成從上至下4%~30%的均勻濃度梯度凝膠，其網(wǎng)眼孔徑從上至下越來越小，電泳時(shí)，不同Pr主要依r大小而別離，即分子篩效應(yīng)>電荷效應(yīng),可用于測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量。.5、SDSSDS：十二烷基硫酸鈉CH3〔CH2〕11SO4Na2在配制凝膠時(shí)參加SDS，同時(shí)加巰基乙醇，Pr在電泳時(shí)，其中的寡聚體Pr解聚為單體〔亞基〕，SDS分子就將每個(gè)單體分子外表覆蓋起來，使其形成短軸為1.8nm，而長(zhǎng)軸各異的SDS—亞基復(fù)合物，電泳時(shí)，他們的外表電荷根本相同，故可因分子長(zhǎng)軸大小〔即亞基分子大小〕差異而別離，換言之，亞基的大小是彼此別離的依據(jù)，所以此法可用于測(cè)定單體的相對(duì)分子質(zhì)量。.6、PAGE的一般操作程序配制各種制膠的貯存液準(zhǔn)備制膠模具配制鑄膠混合液灌注膠液并聚合成凝膠上槽點(diǎn)樣通電電泳取出凝膠Pr染色漂洗顯帶記錄計(jì)算繪制電泳圖譜...SDS測(cè)定蛋白質(zhì)〔亞基〕的相對(duì)分子質(zhì)量〔Mr〕與它們的電泳遷移率〔U〕之間，存在如下關(guān)系：

lgMr=lgK-bU

用lgMr對(duì)U作圖，只要實(shí)驗(yàn)測(cè)得，就可用標(biāo)準(zhǔn)曲線法求得未知蛋白質(zhì)〔亞基〕的相對(duì)分子質(zhì)量。實(shí)際工作中，常用相對(duì)遷移率〔用mR表示〕代替U作圖。mR=蛋白質(zhì)移動(dòng)的距離溴酚藍(lán)移動(dòng)的距離.三、等電點(diǎn)聚焦電泳〔IEFisoelectricfocusing〕1、等電點(diǎn)聚焦電泳別離Pr原理等電點(diǎn)聚焦電泳是在電泳介質(zhì)中參加兩性離子載體，電泳時(shí)形成由陽極到陰極的連續(xù)遞增的pH梯度，蛋白質(zhì)按其電荷性質(zhì)不同各自向著與其等電點(diǎn)相等的pH處移動(dòng)聚焦，從而彼此別離的電泳技術(shù)，無論P(yáng)r從正極出發(fā)或是從負(fù)極出發(fā)，都會(huì)聚焦在等電點(diǎn)處。2、兩性離子載體

各組分的pI值十分接近，在電泳中可以形成連續(xù)的pH梯度，常用的商品名為Ampholine，規(guī)格有pH3.5~9.0和精細(xì)分級(jí)的pH3.5~5、5~9、9~11的多種商品可供不同的要求使用。.第五節(jié)酶液的濃縮、結(jié)晶、枯燥與成型一、稀酶液的濃縮濃縮是從稀溶液中除去一局部溶劑〔水〕，使其變成濃縮液的工藝。酶液濃縮的方法很多：如沉淀，低溫真空蒸發(fā)、超濾等。二、結(jié)晶1、結(jié)晶的一般原理不飽和溶液飽和溶液過飽和溶液析出沉淀（快）析出結(jié)晶（慢）（無排列排隊(duì)機(jī)會(huì)）.2、結(jié)晶“三步曲〞第一步：形成過飽和溶液——稍微越過飽和狀態(tài)，處于介穩(wěn)態(tài)，濃縮、降溫〔少有升溫〕、調(diào)節(jié)pH至pI，可使溶液趨于過飽和。第二步：形成晶核——過飽和溶液在一定條件下可形成極微小的有序排列的固相物，成為后續(xù)晶體生長(zhǎng)的核心，稱為晶核。振蕩、攪拌、快速降溫可促使過飽和溶液形成晶核，有時(shí)可投入少量“晶種〞微粒。第三步：晶體生長(zhǎng)——溶質(zhì)在晶核周邊不斷有序排列，晶體逐步長(zhǎng)大，控制條件，如緩慢攪拌、適當(dāng)升溫使細(xì)小晶體溶解，溶質(zhì)到大晶體周圍集結(jié)生長(zhǎng)。.