細胞工程學(xué)：第15章 干細胞

第15章干細胞本章主要內(nèi)容15.1干細胞：定義、特點、分類與應(yīng)用15.2胚胎干細胞：分離、培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化與篩選、存在問題15.3成體干細胞：分離、培養(yǎng)、存在問題本節(jié)關(guān)鍵問題干細胞誘導(dǎo)分化方法視頻：干細胞研究簡介/v_show/id_XMTQ3NzIwNjk2.html（一）定義干細胞是一類具有自我更新和分化潛能的細胞。15.1干細胞（二）干細胞特征1.自我更新特征自我更新是指干細胞具有分裂和自我復(fù)制能力。（1）對稱分裂（symmetricdivision）是指一個干細胞分裂產(chǎn)生的兩個子細胞全是干細胞。（2）不對稱分裂（asymmetricdivision）是指一個干細胞分裂成一個干細胞和一個短暫增殖細胞（稱之為祖細胞，progenitorcell)。祖細胞分裂形成的是兩個專一功能的子細胞，不具備自我復(fù)制的能力。2.分化特征（1）單能干細胞（Monopotentstemcell)是只能分化為單一類型細胞的干細胞。例如表皮的基質(zhì)細胞（即表皮干細胞）只能分化產(chǎn)生角化表皮細胞。（2）多能干細胞（Multipotentstemcell）是能夠形成兩種或兩種以上類型細胞的干細胞。例如骨髓造血干細胞就是典型的多能干細胞，可以分化成紅細胞、巨噬細胞、粒細胞（中性、嗜堿性、嗜酸性）、巨核細胞（發(fā)育成血小板）、淋巴細胞（至少6種以上的淋巴細胞）等多種類型細胞。（3）全能干細胞（Almightystemcell）是具有無限分化潛能的干細胞。例如胚胎干細胞。3.增殖特征（1）增殖的緩慢性一般情況下，干細胞處于休眠或緩慢增殖狀態(tài)。緩慢增殖還可以減少基因發(fā)生突變的可能性。（2）增殖的自穩(wěn)性也稱自我維持，是指干細胞會自我更新維持自身數(shù)目的恒定，主要是通過不對稱分裂來實現(xiàn)。（三）干細胞應(yīng)用干細胞生物學(xué)被1999年美國《科學(xué)》推舉為二十一世紀(jì)最重要的十項科學(xué)領(lǐng)域之首。1.組織或器官修復(fù)《科學(xué)日報》2010年5月27日報道，美國加州大學(xué)歐文分校（UCIrvine）的科學(xué)家們用人類胚胎干細胞培育出一種早期階段的視網(wǎng)膜，為開發(fā)可移植性視網(wǎng)膜來治療人類視網(wǎng)膜病變邁出了第一步——JournalofNeuroscienceMethods。視網(wǎng)膜祖細胞，后者進一步分化為具有三維結(jié)構(gòu)的組織薄片2.疾病治療甲型糖尿病稱之為胰島素依賴性糖尿病，病人胰臟不能正常地分泌胰島素。必須通過注射胰島素來控制血糖含量，通常情況下患者一天最少需要注射四次。2007年4月11日：英國《泰晤士報》在頭版報道了用干細胞技術(shù)治療糖尿病取得了重大突破，擺脫對胰島素的依賴。干細胞分類不同的干細胞具有不同的分化潛能。分化功能：干細胞可分為單能干細胞、多能干細胞與全能干細胞。全能干細胞從理論上可以分化成所有組織與器官。來源：干細胞包括成體干細胞和胚胎干細胞。1.定義胚胎干細胞簡稱ES(EmbryoStem)細胞，是一種全能干細胞，它是從著床前胚胎內(nèi)細胞團或原始生殖細胞經(jīng)體外分化抑制培養(yǎng)分離的一種全能性細胞系，可以分化成任何一種組織類型的細胞。15.2胚胎干細胞2.胚胎干細胞的分離（來源）（1）分離自胚胎內(nèi)細胞團從早期胚胎內(nèi)細胞團（Innercellmass,ICM）分離是獲得胚胎干細胞的主要途徑。ES細胞一般是指該途徑分離到的胚胎干細胞。（2）分離自原始生殖細胞從原始生殖細胞分離的干細胞稱為胚胎生殖細胞（Embryonicgermcell,EGC），簡稱EG細胞。通過獲取原始生殖細胞移動到的相應(yīng)組織就可以獲得原始生殖細胞。具體時間根據(jù)不同動物而異，例如：小鼠取12.5天的胎兒生殖嵴，人取5-9周齡的胎兒背腸系膜或者生殖嵴。（3）分離自胚胎瘤細胞胚胎瘤細胞（embryoniccarcinomacell）是可以形成畸胎瘤的細胞。分離自胚胎瘤細胞的干細胞稱為EC細胞，其轉(zhuǎn)化成惡性腫瘤的可能性小。3.胚胎干細胞的鑒定堿性磷酸酶（Alkalinephosphatases,AKP）活性：未分化的胚胎干細胞中含有豐富的堿性磷酸酶，活性很高；而已經(jīng)分化的胚胎干細胞中堿性磷酸酶呈現(xiàn)弱陽性或陰性。端粒酶（Telomerase）活性：端粒酶是增加染色體末端端粒序列、維持端粒長度的一種核糖蛋白。端粒酶有助于維持端粒長度，胚胎干細胞有著高水平的端粒酶活性，并具有長的端粒。干細胞標(biāo)記物是位于細胞表面可以有選擇性地結(jié)合和粘附信號分子的受體蛋白。根據(jù)不同的干細胞的特征標(biāo)記物可以鑒別不同的干細胞，結(jié)合熒光標(biāo)記、流式細胞儀可以實現(xiàn)干細胞的分離。達SSEA-1例如：胚胎干細胞為未分化細胞，能表達早期胚胎細胞的階段特異性胚胎抗原（Stage-specificembryonicantigen，SSEA）。靈長類ES細胞表達SSEA-3、SSEA-4及高分子糖蛋白TRA-1-60、TRA-1-81等。原始生殖細胞源的人類胚胎干細胞還表達SSEA1、SSEA-3，SSEA-4表達量有所下降。4.胚胎干細胞體外培養(yǎng)方法（1）培養(yǎng)基與消化液要求對培養(yǎng)基要求較高：高糖：葡萄糖>4500mg/L；高谷胺酰胺：滿足干細胞旺盛分裂對蛋白和核酸的需要；高血清：15%胎牛血清B-巰基乙醇：抑制細胞分化、促進細胞分裂、防止氧化損害。高濃度消化液：胰蛋白酶和EDTA濃度均高于一般動物細胞，因為胚胎干細胞間結(jié)合緊密。（2）飼養(yǎng)層培養(yǎng)法主要應(yīng)用小鼠胚胎原代成纖維細胞（PMEF）和小鼠胎兒成纖維細胞耐硫代鳥嘌呤（SIM）和耐烏苯苷亞系（STO）細胞作為飼養(yǎng)層細胞。功能：PMEF和STO都能分泌促進胚胎干細胞增殖和抑制胚胎干細胞分化的因子——白血病抑制因子（LIF）。白血病抑制因子（Leukemiainhibitoryyfactor，LIF）一種天然細胞因子，因可以抑制白血病細胞系M1的生長和分化而得名。（3）條件培養(yǎng)基與細胞因子在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入抑制分化因子如LIF和促細胞分裂生長因子等成份制備成條件培養(yǎng)基。目的：保證胚胎干細胞增殖的同時維持未分化的二倍體狀態(tài)。除LIF外，細胞因子還有：堿性成纖維生長因子（Basicfibroblastgrowthfactorb,FGF）是一種與肝素結(jié)合的多肽類絲裂原（mitogen），是一重要的細胞增殖與分化調(diào)節(jié)劑。有研究發(fā)現(xiàn)無血清培養(yǎng)基中添加人的堿性成纖維生長因子（bFGF）利于保持胚胎干細胞的未分化狀態(tài)。5.胚胎干細胞培養(yǎng)流程（1）胚胎內(nèi)細胞團獲得：囊胚，剝離，胰酶消化。（2）原代培養(yǎng)：飼養(yǎng)層培養(yǎng)，細胞團似鳥巢。（3）傳代培養(yǎng)：消化后接種于新的飼養(yǎng)層并添加促進增殖和抑制分化因子進行條件培養(yǎng)。2d更換培養(yǎng)液，3-4d傳代一次。還要使用明膠或纖維連接蛋白等包被培養(yǎng)皿增強貼附性生長。（4）胚胎干細胞分化潛能評價與鑒定（1）體外分化實驗將獲得的胚胎干細胞制成懸浮液培養(yǎng)在鋪有明膠的培養(yǎng)皿中，一段時間后部分細胞貼壁生長，分化成神經(jīng)、肌肉、軟骨等不同細胞。不貼壁的懸浮培養(yǎng)。（2）體內(nèi)分化實驗將一定量的胚胎干細胞注射進同源動物皮下，有組織瘤生成，制片觀察。（3）嵌合體形成將胚胎干細胞通過聚集法或者注射法與受體胚胎結(jié)合，并且將胚胎移植進同期化代孕母受體，各自表達自己的基因型，最終得到嵌合體動物，再通過毛色、膚色等判定或同工酶鑒定。（4）核移植移植胚胎干細胞的核，觀察重組胚是否正常發(fā)育產(chǎn)生個體。應(yīng)用舉例胚胎干細胞向內(nèi)皮細胞的誘導(dǎo)分化（1）胚胎干細胞培養(yǎng)DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、白血病抑制因子、青霉素等采用有飼養(yǎng)層細胞的培養(yǎng)方法現(xiàn)象：ES細胞在飼養(yǎng)層上彼此緊密黏附在一起，呈鳥巢狀生長。集落大時需要消化傳代。（2）胚胎干細胞誘導(dǎo)分化ES細胞懸浮培養(yǎng)加10-9mol/l的維甲酸，每2天更換培養(yǎng)基1次，5天后各自形成擬胚體。

胚胎干細胞細胞系的最早成功建立（1）小鼠：1981年1981年，英國劍橋大學(xué)的埃文斯（Evans）和考夫曼（Kaufman）從小鼠囊胚期的內(nèi)細胞團獲取細胞，首先建成ES細胞系。2007年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎。將細胞標(biāo)記綠 色熒光蛋白

(GFP)，起到

示蹤作用（2）人類：1998年1998年美國：Thomson小組從4個體外受精培養(yǎng)至囊胚的內(nèi)細胞團進行體外培養(yǎng)、傳代得到5個人類ES細胞系。6.胚胎干細胞體外誘導(dǎo)分化與篩選添加不同種類和不同濃度的化學(xué)物質(zhì)或細胞因子等誘導(dǎo)條件，促進ES細胞定向分化為某種特殊類型的細胞。或通過改變培養(yǎng)條件對某些類型的細胞分化起抑制作用，從而高效誘導(dǎo)目的細胞的分化。1.細胞因子誘導(dǎo)法細胞因子能顯著改變ES細胞的發(fā)育（分化）途徑。先得到類胚體（EBs）

，再誘導(dǎo)其分化。例如：神經(jīng)生長因子(NGF)可促進類胚體中神經(jīng)元樣細胞的形成。成纖維細胞生長因子一2(FGF2)能使Es細胞分化的神經(jīng)祖細胞進一步分化為功能性神經(jīng)元。巨噬細胞集落刺激因子(M—CSF)可抑制造血細胞發(fā)育和誘導(dǎo)巨噬細胞分化。粒細胞一巨噬細胞集落刺激因子(GM—CSF)則使ES細胞分化為樹狀細胞(DC)。再例如：視黃酸(又稱維甲酸，RA)就是一種強烈的分化誘導(dǎo)劑。在胚胎發(fā)育過程中，RA沿胚軸形成濃度梯度，影響胚胎背腹部和四肢的形成，從而推測其對胚胎發(fā)育起重要的激素樣調(diào)節(jié)作用。一般認(rèn)為維甲酸進入細胞后，首先與細胞質(zhì)中CRABP(cellularRAbindingprotein)形成復(fù)合物，然后復(fù)合物進入核內(nèi)，維甲酸與染色質(zhì)上的受體結(jié)合，從而調(diào)控一系列基因的表達，使細胞的表型發(fā)生轉(zhuǎn)變。維生素C(VC)、維生素K3(VK3)、過氧化氫、β一磷酸甘油、地塞米松和2，5一羥基維生素D3，二甲基亞砜(DMSO)等化學(xué)試劑也能誘導(dǎo)胚胎干細胞定向分化成為一些特種類型細胞。2.特異性轉(zhuǎn)錄因子異位表達法（基因調(diào)控法）若把在特定發(fā)育階段中起決定作用的特異性轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)隕S細胞基因組中，將會使細胞準(zhǔn)確地分化為某一特定類型的細胞。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將選擇性標(biāo)記基因如抗生素基因、GFP導(dǎo)入ES細胞，再進行定向篩選某一類型分化的細胞。3.選擇性標(biāo)記基因篩選目的細胞7.胚胎干細胞研究存在的問題1.胚胎干細胞優(yōu)點無限分化潛能的全能性干細胞2.胚胎干細胞研究存在問題（1）來源限制：因為需要人類胚胎作為分離材料。來源限制問題。（2）體外培養(yǎng)困難：由于胚胎干細胞在體外培養(yǎng)會自發(fā)分化，而且機制還不非常清楚，控制胚胎干細胞分化的抑制的技術(shù)有待完善，例如飼養(yǎng)層細胞與條件培養(yǎng)基還不成熟。（3）安全性：胚胎干細胞的自發(fā)分化方向是多向的，移植到體內(nèi)的干細胞的分化方向會與預(yù)期不同。干細胞移植后的成瘤性風(fēng)險也比較大。異體移植仍能引起免疫排斥反應(yīng)。（4）倫理道德問題：獲取人的胚胎干細胞、建立胚胎干細胞系必須要破壞胚囊，體外培養(yǎng)的胚囊是否具有生命還存在著爭議，所以人類胚胎干細胞研究面臨倫理道德問題。15.3成體干細胞1.定義成體干細胞是指成體組織內(nèi)具有更新和進一步分化潛能的細胞。是單或多能干細胞成體干細胞的可塑性指成體干細胞可以突破其“發(fā)育限制性”，分化為其他類型組織細胞。例如：骨髓來源的干細胞在特定環(huán)境中可向肝臟、胰腺、肌肉及神經(jīng)細胞分化；肌肉、神經(jīng)干細胞也可向造血細胞分化。2.成體干細胞優(yōu)點（1）來源方便：可以從自身獲得。（2）沒有倫理學(xué)問題：成體干細胞來自成熟個體，不會損傷供體。（3）避免免疫排斥反應(yīng)：同種異體胚胎干細胞及其分化細胞用于臨床會引起免疫排斥。盡管通過采取自身供體細胞核通過治療性克隆可以得到自身胚胎干細胞，但是克隆技術(shù)的不成熟限制了目前的應(yīng)用。（4）比較安全：雖然胚胎干細胞能分化成各種細胞類型，但目前還不能完全控制胚胎干細胞的定向分化，容易導(dǎo)致畸胎瘤。相對而言，成體干細胞比較安全。與胚胎干細胞相比的優(yōu)點3.成體干細胞分離培養(yǎng)：發(fā)現(xiàn)與分離是關(guān)鍵體內(nèi)含量非常少：血液中每100萬個只有一個干細胞。每1×105骨髓單個核細胞中有2-5個骨髓干細胞。成體干細胞具有特征細胞表面標(biāo)志物（受體蛋白）：例如：CD133、CD34--神經(jīng)干細胞；CD71、CD90--間質(zhì)干細胞；等。通過設(shè)計針對特殊受體的標(biāo)記物，處理細胞，熒光檢測，有熒光的說明是干細胞，并可采用流式細胞儀進行分離干細胞。流式細胞儀分離干細胞成體干細胞的分離來源已經(jīng)報道的含有干細胞的成體組織包括：腦、骨髓、外周血液、血管、骨骼肌、皮膚和肝臟。神經(jīng)干細胞（NSC）：分化成神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞。標(biāo)記物有神經(jīng)上皮干細胞蛋白和一種RNA結(jié)合蛋白。造血干細胞（MGSC)：骨髓造血干細胞、臍帶血造血干細胞。標(biāo)記物主要是高度糖基化跨膜蛋白CD34間質(zhì)干細胞（MSC）：骨髓、臍帶血、脂肪等來源標(biāo)記物有CD71、CD90、CD44等。成體干細胞培養(yǎng)——例子1：脂肪干細胞脂肪組織來源干細胞(adiposetissue—derivedstemcells，ADSCs)是位于脂肪基質(zhì)內(nèi)的一種細胞，具有多向分化潛能。可以定向分化成多種細胞類型，諸如脂肪細胞、平滑肌細胞、軟骨細胞、成骨、神經(jīng)、血管、肝臟、血管內(nèi)皮細胞等。細胞獲取常用膠原酶消化、含血清DMEM液貼壁生長的方法（前面介紹的動物細胞培養(yǎng)技術(shù)）。成體干細胞培養(yǎng)——例子2：臍帶血干細胞臍帶血是胎兒娩出、臍帶結(jié)扎并離斷后殘留在胎盤和臍帶中的血液通常是廢棄不用的。近十幾年的研究發(fā)現(xiàn)，臍帶血中含有可以重建人體造血和免疫系統(tǒng)的造血干細胞，可用于造血干細胞移植，治療多種疾病。因此，臍帶血已成為造血干細胞的重要來源，特別是無血緣關(guān)系造血干細胞的來源。臍帶血中的造血干細胞可以用來治療多種血液系統(tǒng)疾病和免疫系統(tǒng)疾病，包括血液系統(tǒng)惡性腫瘤（如急性白血病、慢性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、骨髓異常增生綜合癥、淋巴瘤等）、血紅蛋白?。ㄈ绾Ｑ笮载氀?、骨髓造血功能衰竭（如再生障礙性貧血）、先天性代謝性疾病、先天性免疫缺陷疾患、自身免疫性疾患、某些實體腫瘤（如小細胞肺癌、神經(jīng)母細胞瘤、卵巢癌，進行性肌營養(yǎng)不良等）。4.成體干細胞研究存在的問題（1）由于成體干細胞在組織中含量極少，又缺乏特異性檢測標(biāo)志，因此很難從組織中分離純化出來。（2）成體干細胞的可塑性機制還不清楚，可能是幾種混雜例如：脂肪組織來源的干細胞不能排除隨血液進入脂肪組織的造血干細胞或其他類型的干細胞。要確定一種成體干細胞的確切的組織來源還需要進行大量深入的研究。（3）成體干細胞體外長期傳代后會發(fā)生表型的改變，且成體干細胞也參與腫瘤的形成。因此，有關(guān)成體干細胞的生物學(xué)安全性也越來越受到人們的關(guān)注?；虿煌愋透杉毎只Y(jié)果。最新進展角度：尋找新的干細胞來源1.皮膚細胞來源干細胞（1）2007年，日美科學(xué)家成功地用人類皮膚細胞培養(yǎng)出了誘導(dǎo)性多功能干細胞。由于這項研究解決了胚胎干細胞研究所面臨的倫理問題，因此將徹底改變干細胞研究的科學(xué)與政策，為生物醫(yī)學(xué)研究開辟新的方向。美國威斯康星大學(xué)詹姆斯·湯姆森實驗室的研究發(fā)表在《科學(xué)》雜志，而日本京都大學(xué)教授山中伸彌領(lǐng)導(dǎo)的研究小組把報告發(fā)表在《細胞》雜志。（2）《自然》雜志：2009年3月3日英加研究員開發(fā)出不必使用病毒的皮膚干細胞新技術(shù)。（3）《細胞》雜志：2009年3月8日美科學(xué)家成功移除誘導(dǎo)多功能干細胞中致癌基因。俞君英進展2：肝胃細胞來源干細胞2008年2月14美國《科學(xué)》雜志：京都大學(xué)教授山中伸彌等人利用成體實驗鼠的肝和胃細胞培育出誘導(dǎo)多功能干細胞（ｉＰＳ）。3.上海交大的相關(guān)研究進展（1）第一次證明了iPS細胞的全能性2009年7月23日，國際權(quán)威科學(xué)雜志《自然》（Nature）在線刊發(fā)了我校曾凡一和中國科學(xué)院動物所研究員周琪等的合作研究成果，首次利用iPS細胞通過四倍體囊胚注射得到存活并具有繁殖能力的小鼠，從而在世界上第一次證明了iPS細胞的全能性。第一出生的iPS小鼠被命名“小小”（Tiny）。iPS細胞全稱為誘導(dǎo)性多能干細胞(inducedpluripotentstemcell)，是由體細胞誘導(dǎo)而成的干細胞，具有和胚胎干細胞類似的發(fā)育多潛能性。（2）卵巢雌性生殖干細胞上世紀(jì)20年代以來一直認(rèn)為：女性和絕大多數(shù)雌性哺乳動物卵母細胞的產(chǎn)生僅發(fā)生在胎兒期，出生后卵母細胞數(shù)目只會不斷減少。2009年4月13日，《自然—細胞生物學(xué)》（NatureCellBiology）報道了上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院吳際教授團隊的研究成果：在成年哺乳動物的卵巢中發(fā)現(xiàn)了雌性生殖干細胞，并證明其可以不斷分化出卵母細胞。（3）卵巢癌干細胞美國頂尖腫瘤研究雜志《癌癥研究》（CancerResearch）2008-7:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院婦產(chǎn)科張殊博士在國際上首次成功從人卵巢癌組織中分離、鑒定出人卵巢癌干細胞，這一發(fā)現(xiàn)將使從根本上抑制卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展成為可能。（4）干細胞移植人獸嵌合體2006-06-23上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳研究所黃淑幀教授等采用子宮內(nèi)注射技術(shù)，將人臍血造血干細胞注入山羊胚胎內(nèi)，在出生小羊的多個器官組織中檢測到該細胞的植入和分化。這種異種嵌合體的建立，有可能為制造人源蛋白提供生物反應(yīng)器，為異種器官移植，免疫耐受以及干細胞的植入、生長、分化、基因表達等方面的研究提供模型。2.骨髓移植骨髓移植(Bonemarrowtransplantation)是各種血液腫瘤（白血病、惡性淋巴瘤）、再生不良性貧血癥、重度地中海型貧血癥以及一些先天性免疫缺乏癥或