高產(chǎn)藍(lán)色素酵母基因工程菌的發(fā)酵條件優(yōu)化

摘要.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀近年來，市場對天然靛.藍(lán).的需求與日俱增,目前在國內(nèi)外市場上靛.藍(lán).主要應(yīng)用于紡織業(yè)如棉織物、羊毛、絲.綢的染色方面,在地毯和手工藝品上也有應(yīng)用[2]。像美國和韓國，通過編輯大腸桿菌基因的技術(shù)產(chǎn)生天然生物靛藍(lán)，有效地應(yīng)用于織物中。當(dāng)下，食品工業(yè)化的快速發(fā)展，全球?qū)τ谑称飞氐男枨罅靠谝嬖黾?。其中，食用紅色素和食用黃色素較之藍(lán)色素附占來源極為廣泛，目前食用的藍(lán)色素的種類很少，且來源非常有限。目前在我國廣泛使用的食用藍(lán)色素主要是靛藍(lán)色素、扼了藍(lán)色素和藻藍(lán)蛋白（即藻藍(lán)素）三種[3]。我國早在3600年前的夏朝就使用植物靛藍(lán)染料，它是藍(lán)草（菘藍(lán)、蓼藍(lán)、馬藍(lán)等）經(jīng)發(fā)酵提煉后制得的最早的天然染料，主要含有靛藍(lán)和靛玉紅（5%~20%）兩種色素成分，及少量的靛棕、靛黃等色素[4]。經(jīng)其染色纖維及紡織品色調(diào)高雅、手感豐滿、安全健康，并具有良好的藥用價值（抗菌、消炎等）和較高的藝術(shù)價值（扎染、藍(lán)印花布等），但也存在成本較高、染色重現(xiàn)性較差等缺點(diǎn)[5]。1.2.1靛藍(lán)色素的合成機(jī)理早在1928年研究人員就發(fā)現(xiàn)假單胞菌（Pseudomonasindoloxidaes）能夠氧化吲哚合成靛藍(lán)。目前已發(fā)現(xiàn)多種微生物能夠合成靛藍(lán)，如以萘為碳源的Pseudomonasputida菌株P(guān)pG7、有能夠降解甲苯-二甲苯其它衍生物的P.putida菌株mt-2、降解甲苯的P.mendocina菌株KR1、降解苯乙烯的P.putida菌株S12和CA-3、以1，2，3，4四氫化萘為碳源的Sphingomonasmacrogolitabida等。當(dāng)前，靛藍(lán)生物轉(zhuǎn)化的研究已經(jīng)從篩選自然界中能夠合成靛藍(lán)的菌株，發(fā)展到進(jìn)行工程菌的構(gòu)建，并從實(shí)驗(yàn)室研究開始進(jìn)入工業(yè)化生產(chǎn)。但是在構(gòu)建高效工程菌株、優(yōu)化發(fā)酵參數(shù)、簡化靛藍(lán)提取過程等方面，仍然有待進(jìn)一步的研究與開發(fā)。靛藍(lán)色素是一種脂溶性偶氮類色素，能夠溶解于少數(shù)幾種有機(jī)溶劑，且穩(wěn)定性較差，容易褪色,目前關(guān)于環(huán)境因素對靛藍(lán)穩(wěn)定性的研究較少，靛藍(lán)降解機(jī)制仍不明確。1983年Ensley等發(fā)現(xiàn)，吲哚可被雙加.氧酶轉(zhuǎn)化成3-羥基吲哚（吲哚酚），而3-羥基吲哚在接觸空氣后被氧化成靛藍(lán)。由此，初步闡明了靛藍(lán)生物轉(zhuǎn)化的機(jī)制[5]。后期研究發(fā)現(xiàn)，具有合成靛藍(lán)能力的微生物大多數(shù)都是芳烴降解菌，通過單加氧酶或雙加氧酶催化吲哚或其氧化物合成靛藍(lán)色素。與化學(xué)合成色素相比，微生物發(fā)酵不受原料資源限制，且具有高效、高選擇性、條件溫和以及綠色安全等特點(diǎn)。野生型菌株催化合成靛藍(lán)體系中因存在旁路反應(yīng)、副反應(yīng)，靛藍(lán)產(chǎn)量一般較低。因此，利用基因工程技術(shù)構(gòu)建催化靛藍(lán)合成關(guān)鍵酶的超量表達(dá)菌株，是提高靛藍(lán)生物合成量的有效途徑。以吲哚為底.物.合成靛藍(lán)Fig.1Synthesisofindigoviaindoleassubstrate與靛.藍(lán).生物轉(zhuǎn)化有關(guān)的酶主要是單加氧酶和雙加氧酶。有的單加氧酶，通過參與甲苯和1-萘酚的代謝，形成靛藍(lán)，有的單氧酶，將吲哚催化為3-羥基吲哚，然后二聚化為靛藍(lán)[6]。在靛.藍(lán).生物轉(zhuǎn)化中，其催化機(jī)制為催化吲哚形成雙羥基酚，然后脫水形成吲哚酚，最后在空氣中氧化聚合形成靛藍(lán)[7]。第2章實(shí)驗(yàn)器材及方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1實(shí)驗(yàn)藥品表2-1實(shí)驗(yàn)過程中使用到的藥品項(xiàng)目試劑名稱生產(chǎn)商1葡萄糖北京市永大化學(xué)試劑有限公司2蛋白胨北京市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司3酵母提取物貴陽太陽生物科技有限公司4瓊脂粉煙臺生工有限責(zé)任公司5AgarCOOLABERSCIENCE6DOSupplemen-UraCOOLABERSCIENCE7半乳糖重慶市宏宇生物有限公司8DMSO昆明浦東試劑廠2.1.2實(shí)驗(yàn)器材表2-2實(shí)驗(yàn)所需儀器項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)儀器型號∕規(guī)格生產(chǎn)廠家1電子天平FA2004A北京菁海有限公司2旋渦震蕩器G560E北京生物科技有限公司3超凈工作臺SW-CJ-20D北京晟源分析化學(xué)儀器制造有限公司4多功能層析柜GYCX-890江蘇國儀有限公司5高壓蒸汽滅菌鍋SX-300上海易聯(lián)醫(yī)療器械廠6實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)FE20梅特勒托利多儀器（上海）有限公司7數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-1江蘇金壇市江南儀器廠8臺式高速微量離心機(jī)Hico21北京珂淮儀器有限公司9高速離心機(jī)CF16RNHitachiKokiCo.Ltd.TokyoJapan10醫(yī)用低溫保存箱MDF-86V340蘇州貝銳儀器科技有限公司11酶標(biāo)儀EPOCHBopTekInstruments，Inc12醫(yī)用冷藏箱YC-80澳柯瑪股份有限公司13電熱恒溫培養(yǎng)箱ZXSD-R1270常州生物質(zhì)能研究所2.1.3實(shí)驗(yàn)試劑YPD液體培養(yǎng)基Y表示酵.母提取物、P表示蛋.白胨、D表示葡.萄糖；其中各物質(zhì)比例為：蛋白胨2%，無水葡.萄.糖2%，酵母提取物1%，用適量去離子水充分溶解。高溫蒸汽除菌（103.4kPa、121℃、15min）。SD液體培.養(yǎng)基，其中各物質(zhì)比例為：DOSupplemen-Ura1.29%，無酵母氨基氮源0.67%，無水葡萄糖2%，它們?nèi)N物質(zhì)須分別配制。三種物質(zhì)的加水比應(yīng)為DOSupplemen-Ura[8]：YNB：無水葡萄糖=8：1：1。無水葡萄糖采取高溫蒸汽除菌（103.4kPa、121℃、15min）的方式進(jìn)行分別單獨(dú)滅菌[9]。待滅菌完成溫度均降至55℃以下后將無水葡萄糖溶液加入SD溶液中，20%葡萄糖溶液配置100m葡萄糖溶液，稱取20g葡萄糖放入錐形瓶，量取80mI蒸餾水加入錐形瓶中，密封放入高壓蒸汽滅菌鍋（103.4kPa、121℃、15min）的方式進(jìn)行滅菌。2.1.5實(shí)驗(yàn)菌株BJ5464（由吉林省生物質(zhì)清潔轉(zhuǎn)化與高值化利用科技創(chuàng)新中心保存）；2.1.6.滅菌、培養(yǎng)基、配置溶劑、離心管、濾器還有各種型號的槍頭等都要進(jìn)行高壓蒸汽滅菌。這種常見的物理滅菌方式適用于普通培養(yǎng)基（例如SD培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基）[10]。高壓蒸汽滅菌的公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)為：在103.4kPa（1.05kg/cm2）的壓強(qiáng)下（即在1.02倍大氣壓下），溫度上升至121.3℃時滅菌15min。另SD培養(yǎng)基中葡萄糖應(yīng)配置葡萄糖溶液，與SD培養(yǎng)基分開滅菌，避免高溫引起葡萄糖變性。進(jìn)行統(tǒng)一滅菌后，再將葡萄糖加入SD培養(yǎng)基中。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1外加色氨酸或吲哚對發(fā)酵產(chǎn)靛藍(lán)的影響實(shí)驗(yàn)第一步需配置SD培養(yǎng)基，YPD培養(yǎng)基與20%葡萄糖溶液，注意在配置過程中調(diào)節(jié)SD培養(yǎng)基與YPD培養(yǎng)基的ph為6.5，因?yàn)榻湍傅淖钸mPH為6.5，而新配制的SD培養(yǎng)基與YPD培養(yǎng)基的PH呈酸性，不適合酵母生長。同時葡萄糖需要單獨(dú)分開滅菌，避免高溫引起葡萄糖發(fā)生熱變形。下午七點(diǎn)鐘進(jìn)行接菌；安全柜打開紫外燈滅菌15分鐘，準(zhǔn)備已滅菌的離心管，SD培養(yǎng)基，釀酒酵母BJ5464。操作時關(guān)掉紫外燈，打開燈光與風(fēng)機(jī)，點(diǎn)燃酒精燈。使用酒精棉擦拭桌面，并用酒精消毒手部。將鑷子放在酒精燈外焰加熱，進(jìn)行滅菌。打開培養(yǎng)基，取5mI的20%葡萄糖溶液加入到45mI的SD培養(yǎng)基中。借著取10mI的SD培養(yǎng)基放入離心管中。用鑷子夾取槍頭在平皿上劃取菌落，放入到離心管中。將離心管放在(30℃，150r)的搖床中進(jìn)行隔夜培養(yǎng)20h.隔天下午三點(diǎn)鐘進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；安全柜打開紫外燈滅菌15分鐘，準(zhǔn)備SD培養(yǎng)基和種子液，操作時關(guān)掉紫外燈，打開燈光與風(fēng)機(jī)，點(diǎn)燃酒精燈。使用酒精棉擦拭桌面，并用酒精消毒手部。按SD溶液體積1%接菌，此時SD培養(yǎng)基體積為40mI，故吸取400uI種子液加入到SD培養(yǎng)基中，將SD培養(yǎng)基放在(30℃，150r)的搖床中進(jìn)行隔夜培養(yǎng)24h.隔天下午三點(diǎn)進(jìn)行5mI體系培養(yǎng)；安全柜打開紫外燈滅菌15分鐘，準(zhǔn)備SD培養(yǎng)基菌液，YPD+色氨酸培養(yǎng)基，離心管，1M吲哚溶液，操作時關(guān)掉紫外燈，打開燈光與風(fēng)機(jī)，點(diǎn)燃酒精燈。進(jìn)行外加色氨酸5mI體系培養(yǎng)時，取2.5mISD菌液加入到離心管中，同時取2.5mI的YPD+色氨酸培養(yǎng)基2.5mI，平行兩組，設(shè)置色氨酸的濃度梯度為5mmol/L;10mmol/L;20mmol/L;40mmol/L;做好標(biāo)記。在外加吲哚的5mI體系中，取2.5mISD菌液加入到離心管中，同時加入2.5mIYPD培養(yǎng)基溶液，設(shè)置吲哚濃度分別為1mmol/L；2mmol/L；4mmol/L；8mmol/L；做好標(biāo)記。將離心管放在(30℃，150r)的搖床中進(jìn)行隔夜培養(yǎng)48h.取出離心管，對稱放置在離心機(jī)中，(2000r；15min)進(jìn)行離心，取出離心管，棄上清，用槍將液體吸取干凈，加入300uI的DMSO溶液，用槍吹吸均勻，使菌落重新懸浮，對稱放置在離心機(jī)中，(2000r；15min)進(jìn)行離心，使用酶標(biāo)儀OD650測量靛藍(lán)含量。2.2.2溫度與搖床轉(zhuǎn)速的影響實(shí)驗(yàn)第一步需配置SD培養(yǎng)基，YPD培養(yǎng)基與20%葡萄糖溶液，注意在配置過程中調(diào)節(jié)SD培養(yǎng)基與YPD培養(yǎng)基的ph為6.5，因?yàn)榻湍傅淖钸mPH為6.5，而新配制的SD培養(yǎng)基與YPD培養(yǎng)基的PH呈酸性，不適合酵母生長。同時葡萄糖需要單獨(dú)分開滅菌，避免高溫引起葡萄糖發(fā)生熱變形。下午七點(diǎn)鐘進(jìn)行接菌；安全柜打開紫外燈滅菌15分鐘，準(zhǔn)備已滅菌的離心管，SD培養(yǎng)基，釀酒酵母BJ5464。操作時關(guān)掉紫外燈，打開燈光與風(fēng)機(jī)，點(diǎn)燃酒精燈。使用酒精棉擦拭桌面，并用酒精消毒手部。將鑷子放在酒精燈外焰加熱，進(jìn)行滅菌。打開培養(yǎng)基，取5mI的20%葡萄糖溶液加入到45mI的SD培養(yǎng)基中。借著取10mI的SD培養(yǎng)基放入離心管中。用鑷子夾取槍頭在平皿上劃取菌落，放入到離心管中。將離心管放在(30℃，150r)的搖床中進(jìn)行隔夜培養(yǎng)20h.隔天下午三點(diǎn)鐘進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；安全柜打開紫外燈滅菌15分鐘，準(zhǔn)備SD培養(yǎng)基和種子液，操作時關(guān)掉紫外燈，打開燈光與風(fēng)機(jī)，點(diǎn)燃酒精燈。使用酒精棉擦拭桌面，并用酒精消毒手部。按SD溶液體積1%接菌，此時SD培養(yǎng)基體積為40mI，故吸取400uI種子液加入到SD培養(yǎng)基中，將SD培養(yǎng)基放在(30℃，150r)的搖床中進(jìn)行隔夜培養(yǎng)24h.隔天下午三點(diǎn)進(jìn)行5mI體系培養(yǎng)；安全柜打開紫外燈滅菌15分鐘，準(zhǔn)備SD培養(yǎng)基菌液，YPD培養(yǎng)基，離心管。每種溫度及轉(zhuǎn)速的搖床設(shè)置平行實(shí)驗(yàn)兩組，做好標(biāo)記。取2.5mISD培養(yǎng)菌液加入到離心管中，再取2.5mI的YPD培養(yǎng)基加入到離心管中，并加入適量的吲哚。將離心管分別放置在三種不同的搖床中，培養(yǎng)48小時。取出離心管，對稱放置在離心機(jī)中，(2000r；15min)進(jìn)行離心，取出離心管，棄上清，用槍將液體吸取干凈，加入300uI的DMSO溶液，用槍吹吸均勻，使菌落重新懸浮，對稱放置在離心機(jī)中，(2000r；15min)進(jìn)行離心，使用酶標(biāo)儀OD650測量靛藍(lán)含量。2.2.3PH對發(fā)酵產(chǎn)靛藍(lán)的影響（1）實(shí)驗(yàn)第一步需配置SD培養(yǎng)基，YPD培養(yǎng)基與20%葡萄糖溶液，注意在配置過程中調(diào)節(jié)SD培養(yǎng)基與YPD培養(yǎng)基的ph濃度梯度為4.0-10.0，共七組，同時葡萄糖需要單獨(dú)分開滅菌，避免高溫引起葡萄糖發(fā)生熱變形。（2）下午七點(diǎn)鐘進(jìn)行接菌；安全柜打開紫外燈滅菌15分鐘，準(zhǔn)備已滅菌的離心管，SD培養(yǎng)基，釀酒酵母BJ5464。操作時關(guān)掉紫外燈，打開燈光與風(fēng)機(jī)，點(diǎn)燃酒精燈。使用酒精棉擦拭桌面，并用酒精消毒手部。將鑷子放在酒精燈外焰加熱，進(jìn)行滅菌。打開培養(yǎng)基，取5mI的20%葡萄糖溶液加入到45mI的SD培養(yǎng)基中。借著取10mI的SD培養(yǎng)基放入離心管中。用鑷子夾取槍頭在平皿上劃取菌落，放入到離心管中。將離心管放在(30℃，150r)的搖床中進(jìn)行隔夜培養(yǎng)20h.（3）隔天下午三點(diǎn)鐘進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；安全柜打開紫外燈滅菌15分鐘，準(zhǔn)備SD培養(yǎng)基和種子液，操作時關(guān)掉紫外燈，打開燈光與風(fēng)機(jī)，點(diǎn)燃酒精燈。使用酒精棉擦拭桌面，并用酒精消毒手部。按SD溶液體積1%接菌，此時SD培養(yǎng)基體積為40mI，故吸取400uI種子液加入到SD培養(yǎng)基中，將SD培養(yǎng)基放在(30℃，150r)的搖床中進(jìn)行隔夜培養(yǎng)24h.（4）隔天下午三點(diǎn)進(jìn)行5mI體系培養(yǎng)；安全柜打開紫外燈滅菌15分鐘，準(zhǔn)備SD培養(yǎng)基菌液，YPD培養(yǎng)基，離心管。每種溫度及轉(zhuǎn)速的搖床設(shè)置平行實(shí)驗(yàn)兩組，做好標(biāo)記。取2.5mISD培養(yǎng)菌液加入到離心管中，再取2.5mI的YPD培養(yǎng)基加入到離心管中，并加入適量的吲哚。將離心管分別放置在三種不同的搖床中，培養(yǎng)48小時。（5）取出離心管，對稱放置在離心機(jī)中，(2000r；15min)進(jìn)行離心，取出離心管，棄上清，用槍將液體吸取干凈，加入300uI的DMSO溶液，用槍吹吸均勻，使菌落重新懸浮，對稱放置在離心機(jī)中，(2000r；15min)進(jìn)行離心，使用酶標(biāo)儀OD650測量靛藍(lán)含量。2.2.4接種量對發(fā)酵產(chǎn)靛藍(lán)的影響（1）實(shí)驗(yàn)第一步需配置SD培養(yǎng)基，YPD培養(yǎng)基與20%葡萄糖溶液，注意在配置過程中調(diào)節(jié)SD培養(yǎng)基與YPD培養(yǎng)基的ph為6.5，同時葡萄糖需要單獨(dú)分開滅菌，避免高溫引起葡萄糖發(fā)生熱變形。（2）下午七點(diǎn)鐘進(jìn)行接菌；安全柜打開紫外燈滅菌15分鐘，準(zhǔn)備已滅菌的離心管，SD培養(yǎng)基，釀酒酵母BJ5464。操作時關(guān)掉紫外燈，打開燈光與風(fēng)機(jī)，點(diǎn)燃酒精燈。使用酒精棉擦拭桌面，并用酒精消毒手部。將鑷子放在酒精燈外焰加熱，進(jìn)行滅菌。打開培養(yǎng)基，取5mI的20%葡萄糖溶液加入到45mI的SD培養(yǎng)基中。借著取10mI的SD培養(yǎng)基放入離心管中。用鑷子夾取槍頭在平皿上劃取菌落，放入到離心管中。將離心管放在(30℃，150r)的搖床中進(jìn)行隔夜培養(yǎng)20h.（3）隔天下午三點(diǎn)鐘進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；安全柜打開紫外燈滅菌15分鐘，準(zhǔn)備SD培養(yǎng)基和種子液，操作時關(guān)掉紫外燈，打開燈光與風(fēng)機(jī)，點(diǎn)燃酒精燈。使用酒精棉擦拭桌面，并用酒精消毒手部。分別按SD溶液體積0%，0.5%，1%，1.5%，2%接菌，吸取種子液加入到SD培養(yǎng)基中，將SD培養(yǎng)基放在(30℃，150r)的搖床中進(jìn)行隔夜培養(yǎng)24h.（4）隔天下午三點(diǎn)進(jìn)行5mI體系培養(yǎng)；安全柜打開紫外燈滅菌15分鐘，準(zhǔn)備SD培養(yǎng)基菌液，YPD培養(yǎng)基，離心管。每種溫度及轉(zhuǎn)速的搖床設(shè)置平行實(shí)驗(yàn)兩組，做好標(biāo)記。取2.5mISD培養(yǎng)菌液加入到離心管中，再取2.5mI的YPD培養(yǎng)基加入到離心管中，并加入適量的吲哚。將離心管分別放置在三種不同的搖床中，培養(yǎng)48小時。（5）取出離心管，對稱放置在離心機(jī)中，(2000r；15min)進(jìn)行離心，取出離心管，棄上清，用槍將液體吸取干凈，加入300uI的DMSO溶液，用槍吹吸均勻，使菌落重新懸浮，對稱放置在離心機(jī)中，(2000r；15min)進(jìn)行離心，使用酶標(biāo)儀OD650測量靛藍(lán)含量2.2.5發(fā)酵時間對產(chǎn)靛藍(lán)的影響（1）實(shí)驗(yàn)第一步需配置SD培養(yǎng)基，YPD培養(yǎng)基與20%葡萄糖溶液，注意在配置過程中調(diào)節(jié)SD培養(yǎng)基與YPD培養(yǎng)基的ph為6.5，同時葡萄糖需要單獨(dú)分開滅菌，避免高溫引起葡萄糖發(fā)生熱變形[18]。（2）下午七點(diǎn)鐘進(jìn)行接菌；安全柜打開紫外燈滅菌15分鐘，準(zhǔn)備已滅菌的離心管，SD培養(yǎng)基，釀酒酵母BJ5464。操作時關(guān)掉紫外燈，打開燈光與風(fēng)機(jī)，點(diǎn)燃酒精燈。使用酒精棉擦拭桌面，并用酒精消毒手部。將鑷子放在酒精燈外焰加熱，進(jìn)行滅菌。打開培養(yǎng)基，取5mI的20%葡萄糖溶液加入到45mI的SD培養(yǎng)基中。借著取10mI的SD培養(yǎng)基放入離心管中。用鑷子夾取槍頭在平皿上劃取菌落，放入到離心管中。將離心管放在(30℃，150r)的搖床中進(jìn)行隔夜培養(yǎng)20h.（3）隔天下午三點(diǎn)鐘進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；安全柜打開紫外燈滅菌15分鐘，準(zhǔn)備SD培養(yǎng)基和種子液，操作時關(guān)掉紫外燈，打開燈光與風(fēng)機(jī)，點(diǎn)燃酒精燈。使用酒精棉擦拭桌面，并用酒精消毒手部。分別按SD溶液體積1%接菌，吸取種子液加入到SD培養(yǎng)基中，將SD培養(yǎng)基放在(30℃，150r)的搖床中進(jìn)行隔夜培養(yǎng)24h.（4）隔天下午三點(diǎn)進(jìn)行5mI體系培養(yǎng)；安全柜打開紫外燈滅菌15分鐘，準(zhǔn)備SD培養(yǎng)基菌液，YPD培養(yǎng)基，離心管。每種溫度及轉(zhuǎn)速的搖床設(shè)置平行實(shí)驗(yàn)兩組，做好標(biāo)記。取2.5mISD培養(yǎng)菌液加入到離心管中，再取2.5mI的YPD培養(yǎng)基加入到離心管中，并加入適量的吲哚。將離心管分別放置在三種不同的搖床中，培養(yǎng)0-55小時，每個五小時取出一組測量靛藍(lán)含量。（5）取出離心管，對稱放置在離心機(jī)中，(2000r；15min)進(jìn)行離心，取出離心管，棄上清，用槍將液體吸取干凈，加入300uI的DMSO溶液，用槍吹吸均勻，使菌落重新懸浮，對稱放置在離心機(jī)中，(2000r；15min)進(jìn)行離心，使用酶標(biāo)儀OD650測量靛藍(lán)含量.2.2.5環(huán)境因素對發(fā)酵產(chǎn)靛藍(lán)的影響（1）實(shí)驗(yàn)第一步需配置SD培養(yǎng)基，YPD培養(yǎng)基與20%葡萄糖溶液，注意在配置過程中調(diào)節(jié)SD培養(yǎng)基與YPD培養(yǎng)基的ph為6.5，同時葡萄糖需要單獨(dú)分開滅菌，避免高溫引起葡萄糖發(fā)生熱變形[18]。（2）下午七點(diǎn)鐘進(jìn)行接菌；安全柜打開紫外燈滅菌15分鐘，準(zhǔn)備已滅菌的離心管，SD培養(yǎng)基，釀酒酵母BJ5464。操作時關(guān)掉紫外燈，打開燈光與風(fēng)機(jī)，點(diǎn)燃酒精燈。使用酒精棉擦拭桌面，并用酒精消毒手部。將鑷子放在酒精燈外焰加熱，進(jìn)行滅菌。打開培養(yǎng)基，取5mI的20%葡萄糖溶液加入到45mI的SD培養(yǎng)基中。借著取10mI的SD培養(yǎng)基放入離心管中。用鑷子夾取槍頭在平皿上劃取菌落，放入到離心管中。將離心管放在(30℃，150r)的搖床中進(jìn)行隔夜培養(yǎng)20h.（3）隔天下午三點(diǎn)鐘進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；安全柜打開紫外燈滅菌15分鐘，準(zhǔn)備SD培養(yǎng)基和種子液，操作時關(guān)掉紫外燈，打開燈光與風(fēng)機(jī)，點(diǎn)燃酒精燈。使用酒精棉擦拭桌面，并用酒精消毒手部。分別按SD溶液體積1%接菌，吸取種子液加入到SD培養(yǎng)基中，將SD培養(yǎng)基放在(30℃，150r)的搖床中進(jìn)行隔夜培養(yǎng)24h.（4）隔天下午三點(diǎn)進(jìn)行5mI體系培養(yǎng)；安全柜打開紫外燈滅菌15分鐘，準(zhǔn)備SD培養(yǎng)基菌液，YPD培養(yǎng)基，離心管。每種溫度及轉(zhuǎn)速的搖床設(shè)置平行實(shí)驗(yàn)兩組，做好標(biāo)記。取2.5mISD培養(yǎng)菌液加入到離心管中，再取2.5mI的YPD培養(yǎng)基加入到離心管中，并加入適量的吲哚。將離心管分別放置在三種不同的搖床中，分別在避光條件下，自然光條件下，紫外光條件下，三組條件下發(fā)酵。（5）取出離心管，對稱放置在離心機(jī)中，(2000r；15min)進(jìn)行離心，取出離心管，棄上清，用槍將液體吸取干凈，加入300uI的DMSO溶液，用槍吹吸均勻，使菌落重新懸浮，對稱放置在離心機(jī)中，(2000r；15min)進(jìn)行離心，使用酶標(biāo)儀OD650測量靛藍(lán)含量.2.2.6靛藍(lán)濃度的測定酶標(biāo)儀法測定發(fā)酵液中靛藍(lán)產(chǎn)量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:將靛藍(lán)標(biāo)品用DMSO溶解定容成50.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后依次稀釋成1、2、4、8μg/mL的濃度梯度，用酶標(biāo)儀測定650nm波長處吸光值，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y=0.9834X－0.0689，Ｒ2=0.9975。發(fā)酵培養(yǎng)基接入底物吲哚反應(yīng)一段時間后，9000r/min離心20min，棄上清，沉淀物加入適量DMSO，再次離心10s后，用酶標(biāo)儀測定650nm波長處吸光值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算靛藍(lán)濃度。發(fā)酵培養(yǎng)基接入底物色氨酸反應(yīng)一段時間后，9000r/min離心20min，沉淀物加入適量DMSO，超聲處理20min，待沉淀全部溶解后用酶標(biāo)儀測定650nm波長處吸光值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算靛藍(lán)濃度。吲哚濃度的測定及轉(zhuǎn)化率的計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作準(zhǔn)確稱取吲哚標(biāo)品，蒸餾水溶解定容成1M吲哚標(biāo)準(zhǔn)溶液，逐步稀釋至1，2，4，8μg/mL，分別量取1mL與對二甲氨基苯甲醛（3g/L）9mL混合，沸水浴加熱2min，滴加1滴2%亞硝酸鈉，繼續(xù)加熱3min，用酶標(biāo)儀測定650nm波長處吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。發(fā)酵培養(yǎng)基接入底物吲哚反應(yīng)一段時間后，9000r/min離心20min，取1mL上清液適當(dāng)稀釋與DMSO反應(yīng)，測定650nm波長處吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算色氨酸濃度。轉(zhuǎn)化率/%=C0-CdC0×100式中：C0———起始發(fā)酵液色氨酸質(zhì)量濃度（mg/mL）；Cd———終止發(fā)酵液色氨酸質(zhì)量濃度（mg/mL）。第3章實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1外加色氨酸與吲哚實(shí)驗(yàn)3.1.1實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖3-1外加色氨酸對靛藍(lán)產(chǎn)量的影響色氨酸濃度（mmol/L)5102040空白產(chǎn)量1（mg/L)0.052350.075240.039270.062160.03273產(chǎn)量2（mg/L)0.071970.100640.013110.078510.009884圖3-2外加吲哚對靛藍(lán)產(chǎn)量的影響吲哚濃度（mmol/L)1248空白產(chǎn)量1（mg/L)0.10140.902550.049080.075240.03273產(chǎn)量2（mg/L)0.13410.644220.039270.078510.009884其中空白組為不加色氨酸或不加吲哚的空白對照組3.1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)初步看出當(dāng)外加色氨酸時對酵母的靛藍(lán)產(chǎn)量幾乎沒有影響，酵母的靛藍(lán)產(chǎn)量增加量非常少，幾乎可以忽略不計(jì)，可以初步認(rèn)為釀酒酵母BJ5464菌株無法利用外源的色氨酸進(jìn)行合成吲哚，即缺少利用外源色氨酸的酶，或者利用色氨酸的酶活性非常微弱。當(dāng)外加吲哚時，可以看到當(dāng)吲哚濃度為2mmol/L時，靛藍(lán)的產(chǎn)量顯著提高，并出現(xiàn)明顯的陽性結(jié)果，可認(rèn)為該菌株可以利用外源吲哚進(jìn)行合成靛藍(lán)。但當(dāng)外源吲哚的含量較少時靛藍(lán)的產(chǎn)量下降，且當(dāng)吲哚的濃度提高時，靛藍(lán)的產(chǎn)量明顯下降，可推測是由于吲哚的含量較高，且吲哚具有毒性，抑制了酵母的生長。可看出外加色氨酸對合成靛藍(lán)并無作用，且當(dāng)外加吲哚的濃度為2mmol/L時，酵母自身可以利用外源吲哚進(jìn)行合成靛藍(lán)，顯著提高靛藍(lán)的產(chǎn)量。推測外加吲哚的最適濃度在2mml/L附近。3.2溫度與搖床轉(zhuǎn)速的影響3.2.1實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)序號一二三產(chǎn)量1（mg/L)0.30240.87500.1024產(chǎn)量2（mg/L)0.20870.82410.1131圖3-3不同溫度及轉(zhuǎn)速下的靛藍(lán)產(chǎn)量一組，二組，三組分別對應(yīng)（30℃，100r);(30℃，150r);(37℃，150r)三種搖床。3.2.2實(shí)驗(yàn)分析二組的靛藍(lán)產(chǎn)量較于以前數(shù)據(jù)比較較為穩(wěn)定，且產(chǎn)量最高。發(fā)現(xiàn)基因工程菌在37℃較于30℃條件下靛藍(lán)的生成下降比較明顯。不同溫度條件下，發(fā)酵所產(chǎn)生的靛藍(lán)色素溶液顏色變化速率呈顯著性差異[11],，室溫條件下靛藍(lán)溶液色度變化緩慢，而37℃下色度變化速度明顯加快，但后期變化較慢，具體原因仍待進(jìn)一步確認(rèn)[12].，在室溫條件下靛藍(lán)溶液色度變化緩慢，而37℃下色度變化速度明顯加快，但后期變化慢，具體原因仍待進(jìn)一步確認(rèn)[13],，物質(zhì)含量的變化情況與光照條件下檢測結(jié)果相似，靛藍(lán)的降解與靛紅的生成同步發(fā)生，但其變化量無對應(yīng)關(guān)系，可初步得出靛藍(lán)降解產(chǎn)物包括靛紅等多種成分[14]。發(fā)現(xiàn)釀酒酵母4℃下進(jìn)行發(fā)酵時，靛藍(lán)色素降解速率和靛紅合成速率最低，在30h之前，隨著溫度的增加，發(fā)酵產(chǎn)靛藍(lán)速率明顯加快，而30h之后，室溫條件下的反應(yīng)速率明顯高于37℃下反應(yīng)速率，該結(jié)果與色度變化實(shí)驗(yàn)一致，具體原因仍待進(jìn)一步確認(rèn)。3.3PH對發(fā)酵產(chǎn)靛藍(lán)的影響3.3.1實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖3-4PH與靛藍(lán)產(chǎn)量的關(guān)系3.3.2數(shù)據(jù)分析發(fā)酵液起始pH對工程菌BJ5464發(fā)酵產(chǎn)靛藍(lán)色素的影響,試驗(yàn)研究了以吲哚為發(fā)酵底物、發(fā)酵液起始pH4.0～10.0時，pH對工程菌BJ5464發(fā)酵產(chǎn)靛藍(lán)色素的影響（圖4）。發(fā)酵液起始pH對靛藍(lán)色素合成代謝影響顯著，先逐漸提高后下降的趨勢呈現(xiàn)明顯正態(tài)勢分布；發(fā)酵液初始pH7.0時，靛藍(lán)色素產(chǎn)量呈現(xiàn)最大值0.8mg/L左右；工程菌在發(fā)酵液起始pH過酸或過堿時都會明顯降低靛藍(lán)產(chǎn)量[15]，其原因可能與不適合菌體生長、抑制其合成代謝途徑關(guān)鍵酶基因表達(dá)或關(guān)鍵酶酶活有關(guān)，不利于代謝產(chǎn)物靛藍(lán)色素的積累[16]。3.4接種量對發(fā)酵產(chǎn)靛藍(lán)的影響3.4.1數(shù)據(jù)分析圖2-5接種量對靛藍(lán)產(chǎn)量的的影響3.4.2數(shù)據(jù)分析接種量對工程菌BJ5464發(fā)酵產(chǎn)靛藍(lán)色素的影響圖2-5表明，不同接種量對工程菌BJ5464發(fā)酵產(chǎn)靛藍(lán)色素的影響較小，在0.4%～2.0%時，靛藍(lán)生成量總體趨勢趨于平坦，這可能由于釀酒酵母在一定時間可達(dá)到較高菌體生物量，因此對靛藍(lán)生成量影響不明顯[17]，顯示為靛藍(lán)產(chǎn)量差異較小。3.5發(fā)酵時間對產(chǎn)靛藍(lán)的影響3.5.1實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖2-6發(fā)酵時間對靛藍(lán)產(chǎn)量的影響3.5.2數(shù)據(jù)分析發(fā)酵時間對工程菌BJ5464發(fā)酵產(chǎn)靛藍(lán)色素的影響圖2-6顯示,工程菌BJ5464發(fā)酵合成靛藍(lán)色素與菌體生長曲線變化類似（適應(yīng)期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期），并有一定相關(guān)性，表明其酵母生長與靛藍(lán)色素合成相伴產(chǎn)生，靛藍(lán)色素可能屬于初級代謝產(chǎn)物[19]。菌體在0～8h適應(yīng)期階段，不斷消耗能源物質(zhì)以供自身生長需要，其靛藍(lán)合成代謝量極低[20]；在8～20h時靛藍(lán)色素生成量迅速提高，呈對數(shù)式增加；在20～30h，靛藍(lán)生成量穩(wěn)定在380mg/L左右；30h以后靛藍(lán)色素分解代謝增強(qiáng)，逐漸消耗降低[21].3.6環(huán)境因素對產(chǎn)靛藍(lán)的影響3.6.1實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖2-7環(huán)境因素對產(chǎn)靛藍(lán)的影響3.6.2數(shù)據(jù)分析不同光照條件下靛藍(lán)色素溶液顏色和物質(zhì)含量的變化前期研究發(fā)現(xiàn)，靛藍(lán)色素溶液顏色隨時間不斷變化，由最初的藍(lán)色最終變化為橘紅色，該顏色與靛紅溶液顏色接近［21－23］。為了揭示靛藍(lán)色素溶液的變化規(guī)律，研究了不同光照條件下靛藍(lán)色素溶液顏色隨時間變化與初始靛藍(lán)和靛紅標(biāo)準(zhǔn)液顏色差異情況。結(jié)果如圖4所示。隨著時間增加，靛藍(lán)色素溶液顏色與初始靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)液總色差不斷增加，即呈現(xiàn)與靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)液顏色差異增加的趨勢;而與初始靛紅標(biāo)準(zhǔn)液總色差不斷減小，即顏色上不斷接近的趨勢。上述結(jié)果從色差水平說明靛藍(lán)色素溶液在變化過程中可能有靛紅的生成，但因其與初始靛紅標(biāo)準(zhǔn)液仍存在色差，說明可能有某種中間產(chǎn)物的存在。此外，不同光照條件下，呈現(xiàn)類似變化規(guī)律，但顏色變化速率明顯不同，光照對靛藍(lán)色素穩(wěn)定性影響極顯著(p＜0.01)。自然光條件下，顏色緩慢變化，紫外線照射能顯著增加變化速率，避光處理能顯著延緩顏色變化。為了進(jìn)一步探究不同光照條件下靛藍(lán)色素溶液色度變化的原因，利用高效液相色譜方法對靛藍(lán)色素溶液中的靛藍(lán)和靛紅含量變化進(jìn)行了檢測。結(jié)果如圖2-7所示。Z在自然光條件下發(fā)酵工程菌BJ5464進(jìn)行產(chǎn)靛藍(lán)反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)靛藍(lán)色素含量緩慢降低，72h后發(fā)現(xiàn)靛藍(lán)降解量達(dá)到初始含量的50%以上，同時可見靛紅含量增加至靛藍(lán)初始量的65%。而在紫外光照射下進(jìn)行發(fā)酵時，可見靛藍(lán)降解速率明顯加快，6h后靛藍(lán)含量幾乎為0，而靛紅含量為靛藍(lán)初始量的16%;隨著時間增加，靛紅含量不斷增多，72h靛紅含量增加至靛藍(lán)初始量的65%左右。在避光條件下進(jìn)行發(fā)酵時，在72h后靛藍(lán)含量幾乎不變化且靛紅基本不生成。上述結(jié)果表明靛藍(lán)降解與靛紅生成具有正相關(guān)性，但二者變化速率存在差異。根據(jù)靛紅和靛藍(lán)結(jié)構(gòu)式可知，理論上一份子靛藍(lán)可降解為兩分子靛紅，而上述變化量明顯不符合上述規(guī)律，由此推測靛藍(lán)降解產(chǎn)物組成復(fù)雜，靛紅是主要產(chǎn)物，此外可能有其他中間產(chǎn)物生成。3.6結(jié)論通過基因工程技術(shù)，構(gòu)建了高產(chǎn)靛藍(lán)色素工程菌BJ5464，研究以吲哚為發(fā)酵底物時，環(huán)境因素條件對工程菌其發(fā)酵產(chǎn)靛藍(lán)色素的影響，正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化靛藍(lán)色素生物合成條件[22]。結(jié)果表明，野生菌并無發(fā)酵轉(zhuǎn)化色氨酸合成靛藍(lán)色素的能力，構(gòu)建的苯乙烯單加氧酶基因過表達(dá)工程菌株BJ5464，具有一定的靛藍(lán)色素合成代謝能力[23]；光照對靛藍(lán)色素穩(wěn)定性影響極顯著(p＜0.01)，自然光條件下，顏色緩慢變化。不同接種量對工程菌BJ5464發(fā)酵產(chǎn)靛藍(lán)色素的影響較小，在0.4%～2.0%時，靛藍(lán)生成量總體趨勢趨于平坦，這可能由于釀酒酵母在一定時間可達(dá)到較高菌體生物量，因此對靛藍(lán)生成量影響不明顯[17]，顯示為靛藍(lán)產(chǎn)量差異較小。發(fā)酵液起始pH、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、底物質(zhì)量濃度等因素條件對BJ5464的靛藍(lán)色素合成代謝有一定影響[24]；正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化的發(fā)酵條件為：起始pH6.5、吲哚質(zhì)量濃度1M、發(fā)酵溫度33℃、發(fā)酵時間38h，靛藍(lán)產(chǎn)量達(dá)到0.9mg/L，與未優(yōu)化時靛藍(lán)最高產(chǎn)量0.34mg/L相比，正交試驗(yàn)優(yōu)化使得靛藍(lán)產(chǎn)量提高了近42.9%，接近理論值1.0mg/L；以色氨酸為發(fā)酵底物時，工程菌BJ5464轉(zhuǎn)化合成靛藍(lán)色素產(chǎn)量0.06mg/L左右，吲哚可能是工程菌BJ5464合成靛藍(lán)色素更適宜的發(fā)酵底物[25]。該方面研究為生物轉(zhuǎn)化靛藍(lán)色素提供了理論支持和技術(shù)指導(dǎo)。 參考文獻(xiàn)程雷，陳敏，孫寶國.pseudomonasputidaB4中靛藍(lán)色素合成代謝調(diào)控機(jī)制研究[D].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016任吉元,王文濤,李紅.近期靛藍(lán)生產(chǎn)工藝的研究進(jìn)展[J].染料工業(yè),1997,34(4):22-24程雷，陳敏，孫寶國.pseudomonasputidaB4中靛藍(lán)色素合成代謝調(diào)控機(jī)制研究張華玲.靛藍(lán)染料制備方法及染色工藝的發(fā)展[J].寧德師專學(xué)報(自然科學(xué)版),2010,22(4):364-367.賈秀玲.植物靛藍(lán)染料染色及固色工藝研究[D].上海:東華大學(xué)，2012NICHOLSONSK，JOHNP.Themechanismofbacterialindigoreduction[J].AppliedMicrobiologyandBiotechnology，2005，68（1）：117-123.XIAOQimin，XUTianhong.ExpressionofflavinmonooxygenaseinEscherichiaColiandbiosynthesisofindigo[J].JiangsuScientificandTechnologicalInformation，2016（3）：78-80.（inChinese）NIEYao，F(xiàn)UMinjie，XUYan.Researchprogressconcerningoxygenasefromdifferentmicroorganismsandcatalyticreactionfeature[J].ChineseJournalofBioprocessEngineering，2013（1）：87-93.（inChinese）杜靈燕，張策，車逸心，劉雯嫻，王孟菲，尹勝，王成濤.高產(chǎn)靛藍(lán)色素大腸桿菌工程菌的構(gòu)建及靛藍(lán)色素穩(wěn)定性[J].食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報,2017,（2）：16-38孫寶國，曹雁平，李健，等.食品科學(xué)研究前沿動態(tài)[J].食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報，2014，（2）：1-11.馬橋，曲媛媛，張旭旺，等.靛藍(lán)的微生物合成研究新進(jìn)展[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2012，（2）：344-350.韓曉紅，王偉，肖興國.靛藍(lán)及其同類色素的微生物生產(chǎn)與轉(zhuǎn)化[J].生物工程學(xué)報，2008，（6）：921-926.JEUNJ，JUNGH，KIMJH，etal.Effectofthemonascuspigmentthreoninederivativeonregulationofthecholesterollevelinmice[J].FoodChemistry，2008，107（3）：1078-1085.HANGH，BANGSE，BABUBK，etal.Bio-indigoproductionintwodifferentfermentationsystemsusingrecombinantEscherichiacoli，cellsharboringaflavin-containingmonooxygenasegene（fmo）[J].JournalofBiotechnology，2010，150（3）：369-369.YOOM，KIMD，ZYLSTRAGJ，etal.Biphenylhydroxylationenhancedbyanengineeredo-xylenedioxygenasefromRhodococcussp.strainDK17[J].ResearchinMicrobiology，2011，162（7）：724.O'LEARYND，O'CONNORKE，DOBSONADW.Biochemistry，geneticsandphysiologyofmicrobialstyrenedegradation[J].FemsMicrobiologyReviews，2002，26（4）：403-417.BELTRAMETTIF，MARCONIAM，BESTETTIG，etal.Sequencingandfunctionalanalysisofstyr