酵母雙雜交系統(tǒng)的研究進(jìn)展

酵母雙雜交系統(tǒng)的研究進(jìn)展

蛋白質(zhì)是生命的基礎(chǔ)。體內(nèi)的許多生命活動包括復(fù)制、復(fù)制、分泌、信號傳輸和代謝，這些活動與蛋白質(zhì)物質(zhì)相互作用。對生命活動過程中蛋白質(zhì)作用的研究有助于揭示生命過程中許多物質(zhì)作用的性質(zhì)問題。然而，由于蛋白質(zhì)和其他生物因素的作用取決于細(xì)胞環(huán)境，作用時間和作用方式非常不同，因此傳統(tǒng)的生化方法非常有限。優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)和優(yōu)質(zhì)氨基酸之間的相互作用的研究正在緩慢發(fā)展。在新興的雙無序系統(tǒng)中，有效的細(xì)菌遺傳方法被用來分析蛋白質(zhì)之間的相互作用，它可以快速克隆編碼與特定蛋白質(zhì)作用的配體蛋白質(zhì)基因，并得到廣泛的應(yīng)用。1一般介紹母親繁殖系統(tǒng)1.1dna-bb轉(zhuǎn)錄激活域酵母雙雜交系統(tǒng)是1989年由StanleyFields和OK-KyuSong等提出并初步建立的,該系統(tǒng)是在釀酒酵母中研究蛋白質(zhì)間相互作用的一種非常有效的分子生物學(xué)方法.該系統(tǒng)最初是在人們對酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4的認(rèn)識基礎(chǔ)上建立起來的.一個完整的酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4可分為結(jié)構(gòu)上可以分開的、功能上相互獨立的兩個結(jié)構(gòu)域:位于N端1-147位氨基酸區(qū)段的DNA結(jié)合域(DNABindingDomin,DNA-BD)和位于C端768-881位氨基酸區(qū)段的轉(zhuǎn)錄激活域(DNAActivationDomin,DNA-AD).DNA-BD能夠識別位于GAL4效應(yīng)基因(GAL4-ResponsiveGene)的上游激活序列(UpstreamActivatingSequence,UAS),并與之結(jié)合.DNA-AD則是通過同轉(zhuǎn)錄機(jī)(TranscriptionMachinery)中的其它成分之間的結(jié)合作用,以啟動UAS下游的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄.DNA-BD和DNA-AD單獨分別作用并不能激活轉(zhuǎn)錄反應(yīng),但是當(dāng)二者在空間上較為接近時,則呈現(xiàn)完整的GAL4轉(zhuǎn)錄因子活性并可激活UAS下游啟動子,使啟動子下游報告基因(ReporterGene)得以轉(zhuǎn)錄.將DNA-BD與已知的誘餌蛋白質(zhì)X融合,構(gòu)建出BD-X質(zhì)粒載體;將DNA-AD與cDNA文庫,基因片段或基因突變體(以Y表示)融合,構(gòu)建出AD-Y質(zhì)粒載體.兩個穿梭質(zhì)粒載體共轉(zhuǎn)化至酵母體內(nèi)進(jìn)行表達(dá).該酵母菌株含有特定報告基因(如LacZ,His3,Leu2等),并且本身無報告基因的轉(zhuǎn)錄活性.蛋白質(zhì)X和Y的相互作用導(dǎo)致了DNA-BD和DNA-AD在空間上的接近,從而激活UAS下游啟動子調(diào)節(jié)的報告基因的表達(dá)(圖1),使轉(zhuǎn)化體由于His3或Leu2表達(dá)而可在特定的缺陷培養(yǎng)基上生長,同時因LacZ表達(dá)而在X-Gal存在下顯現(xiàn)藍(lán)色.通過篩選陽性菌落即可檢測已知蛋白質(zhì)間的相互作用和蛋白質(zhì)二聚體的形成,確定蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)構(gòu)域或重要活性位點,以及從cDNA文庫中篩選與已知蛋白質(zhì)X相互作用的未知蛋白質(zhì)Y的編碼序列等.1.2酵母雙雜交系統(tǒng)發(fā)育作用的優(yōu)點酵母雙雜交系統(tǒng)最主要的應(yīng)用是快速、直接分析已知蛋白質(zhì)之間的相互作用及分離新的與已知蛋白質(zhì)作用的配體及其編碼基因.酵母雙雜交系統(tǒng)檢測蛋白質(zhì)之間的相互作用具有以下優(yōu)點:(1)作用信號是在融合基因表達(dá)后,在細(xì)胞內(nèi)重建轉(zhuǎn)錄因子的作用而給出的,省去了純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟.(2)檢測在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行,可以在一定程度上代表細(xì)胞內(nèi)的真實情況.(3)檢測的結(jié)果可以是基因表達(dá)產(chǎn)物的積累效應(yīng),因而可檢測存在于蛋白質(zhì)之間的微弱的或暫時的相互作用.(4)酵母雙雜交系統(tǒng)可采用不同組織、器官、細(xì)胞類型和分化時期材料構(gòu)建cDNA文庫,能分析細(xì)胞漿、細(xì)胞核及膜結(jié)合蛋白質(zhì)等多種不同亞細(xì)胞部位及功能的蛋白質(zhì).2酵母雙雜交系統(tǒng)發(fā)育后的蛋白質(zhì)學(xué)研究酵母雙雜交系統(tǒng)是分析蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間相互作用的有效和快速的方法,有很多方面的應(yīng)用,但仍存在一些局限性,人們針對它的缺點相應(yīng)地進(jìn)行了一些重大改進(jìn),主要有:(1)雙雜交系統(tǒng)分析蛋白質(zhì)間的相互作用定位于細(xì)胞核內(nèi),而許多蛋白質(zhì)間的相互作用依賴于翻譯后加工,如糖基化、二硫鍵形成等,這些反應(yīng)在核內(nèi)無法進(jìn)行.另外有些蛋白質(zhì)的正確折疊和功能有賴于其他非酵母蛋白質(zhì)的輔助,這限制了某些細(xì)胞外蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜受體蛋白質(zhì)等的研究.為此人們初步建立了哺乳動物雙雜交系統(tǒng)作為酵母雙雜交系統(tǒng)的輔助手段.另外還構(gòu)建了SOS恢復(fù)系統(tǒng)和泛素專一性蛋白酶系統(tǒng),針對膜受體、細(xì)胞外分泌蛋白質(zhì)等方面進(jìn)行研究.(2)酵母雙雜交系統(tǒng)的一個重要問題是“假陽性”.由于某些蛋白質(zhì)本身具有激活轉(zhuǎn)錄功能(如RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄激活因子)或在酵母中表達(dá)時發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用,使DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域雜交蛋白質(zhì)在無特異激活結(jié)構(gòu)域的情況下可激活轉(zhuǎn)錄.另外某些蛋白質(zhì)表面含有對多種蛋白質(zhì)的低親和力區(qū)域,能與其他蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定的復(fù)合物,從而引起報告基因的表達(dá),產(chǎn)生“假陽性”的結(jié)果.為了解決這個問題,Marsolier等人提出了建立在RNA聚合酶Ⅲ轉(zhuǎn)錄基礎(chǔ)上的雙雜交系統(tǒng).James等人還構(gòu)建了含三種不同的報告基因(ADE2,HIS3和LacZ)的酵母PJ69-4A菌株,這三種報告基因分別受三種不同的啟動子(Gal1、Gal2和Gal7)調(diào)控,而這三種不同的啟動子都由GAL4激活,該菌株可靈敏地檢測出很弱的結(jié)合作用,從而顯著地消除假陽性.(3)某些誘餌蛋白質(zhì)或待篩選蛋白質(zhì)在酵母中大量表達(dá)時,可能對酵母產(chǎn)生一定的毒性作用,如使酵母體內(nèi)的信號傳導(dǎo)通路阻斷,干擾酵母中正?；虻谋磉_(dá)調(diào)控,抑制酵母細(xì)胞的分裂,甚至使酵母細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基上不能生長等,使得某些種類的蛋白質(zhì)不能在該系統(tǒng)中進(jìn)行分析.針對這些異源蛋白質(zhì)對酵母生長的毒性作用,近年來在雙雜交系統(tǒng)中的主要改進(jìn)是選用更加靈敏的報告基因,從而降低這些異源蛋白質(zhì)在酵母中的表達(dá)量,減輕這些異源蛋白質(zhì)在酵母中的毒性,如采用LexA酵母雙雜交系統(tǒng),該系統(tǒng)中GAL4的BD區(qū)段被原核生物的LexA蛋白質(zhì)編碼區(qū)所取代,單純皰疹病毒的88個VP編碼區(qū)則取代了GAL4的AD區(qū)段.3酵母雙雜交系統(tǒng)的發(fā)展近幾年來,雙雜交系統(tǒng)不斷改進(jìn),發(fā)展出了許多新的技術(shù),對傳統(tǒng)的雙雜交系統(tǒng)作出了重要補充和擴(kuò)展,已成為蛋白質(zhì)之間相互作用研究中充滿活力的一個領(lǐng)域.基于酵母雙雜交系統(tǒng)建立的基礎(chǔ),在1993年發(fā)展出了一種研究蛋白質(zhì)和DNA相互作用的實驗體系酵母單雜交系統(tǒng),另外為了研究阻斷大分子間特定相互作用的機(jī)理,在原有酵母雙雜交系統(tǒng)上發(fā)展起反向酵母雙雜交系統(tǒng)和用于分析蛋白質(zhì)和RNA間相互作用的酵母三雜交系統(tǒng)等.3.1ad-y轉(zhuǎn)錄因子分離酵母單雜交系統(tǒng)的構(gòu)建與雙雜交系統(tǒng)相類似,不同之處在于與轉(zhuǎn)錄激活域AD相融合的待篩選蛋白質(zhì)Y直接與DNA結(jié)合位點相結(jié)合,使AD直接激活啟動子下游報告基因的表達(dá).這一過程無需BD-X的參與,因而通過對AD-Y文庫的篩選可分離出與靶DNA序列直接作用的蛋白質(zhì)Y.該系統(tǒng)為轉(zhuǎn)錄因子的分離鑒定提供了有效的實驗手段.3.2-氟乳清酸5-氟乳清酸突變體ura3Vidal等人采用反式選擇性的報告基因URA3,AD和BD的融合蛋白的相互作用可激活URA3,其編碼的酶使細(xì)胞不能在5-氟乳清酸存在下生長,即表現(xiàn)酵母菌對5-氟乳清酸敏感.相反地,如果融合蛋白質(zhì)的相互作用被阻斷,URA3則不表達(dá),酵母菌則表現(xiàn)對5-氟乳清酸的抗性.因此采用反式雙雜交系統(tǒng)可以很容易地檢出某一蛋白質(zhì)相互作用的另一蛋白質(zhì)的突變體.3.