基因工程基本原理簡介課件

第一節(jié)基因工程原理簡介一、基因工程的定義本義：根據(jù)人們的意愿，利用工程設(shè)計的方法，在體外將克隆獲得的目的基因與適當(dāng)?shù)妮d體進行切割和連接，構(gòu)建成正確的重組表達載體，再應(yīng)用物理的、化學(xué)的或生物學(xué)的方法將該表達載體導(dǎo)入到細菌、動植物細胞或受精卵中，使目的基因在宿主體內(nèi)以瞬時方式或穩(wěn)定方式進行表達，借此研究目的基因/DNA片段的結(jié)構(gòu)與功能，或獲得該基因的表達產(chǎn)物。這一過程就是基因工程。

廣義：轉(zhuǎn)基因動物；克隆；基因打靶；基因組計劃等均屬于基因工程的范疇。目的基因獲得表達載體構(gòu)建基因的導(dǎo)入表達的鑒定核酸鑒定：PCR;SouthernandNorthernblot.蛋白鑒定：SDS;HPLC;Westernblot.功能檢測：機體生理生化功能、性狀的改變。原核:包涵體,分泌型真核:文庫合成PCR基因組文庫cDNA文庫細菌：氯化鈣；電穿孔;細胞：磷酸鈣；脂質(zhì)體；電穿孔；微注射；V;動物：微注射；電穿孔；精子；ESC；RT-V；載體質(zhì)粒(plasmid)粘粒(cosmid)λ噬菌體(λ)第二節(jié)基因工程的基本步驟和方法第三節(jié)基因工程中的通用技術(shù)一、核酸的提取純化與定量包括RNA、DNA及plasmidDNA的提取純化技術(shù)四、Westernblot:Protein一、獲得目的基因的方法

基因文庫（cDNA文庫和基因組文庫），化學(xué)合成，PCR等方法。還有DD-PCR以及基因芯片等技術(shù)。（一）基因組文庫目的：種質(zhì)資源的保護；基因組測序；基因組基因或調(diào)控序列的克隆等。第四節(jié)基因工程中的常用技術(shù)家蠅部分基因組文庫構(gòu)建、卵黃蛋白基因啟動子克隆與初步應(yīng)用研究CloningandinitialapplicationoffunctionalpromoterofMuscadomesticayolkproteingene啟動子克隆一般思路啟動子區(qū)雜交增強子調(diào)控啟動子核心啟動子基因3’

5’轉(zhuǎn)錄起始點探針+50-40ATG-4000-500功能分析

克隆啟動子實驗一、家蠅部分基因組文庫的構(gòu)建

1材料與方法

1.1家蠅基因組DNA的提取

2.1基因組DNA的部分酶切

3.1EMBL3載體臂的制備

4.1連接與包裝

5.1基因組文庫鑒定

BclI隨機酶切

左臂基因組DNA右臂

leftarm（20kb）centralstuff

14kbrightarm9kbEcoRIBamHISalIBamHＩSalIEcoRIＥＭＢＬ３基因組DNABamHI+CIPBclIBclIBamHIBamHI包裝轉(zhuǎn)化KW251噬菌斑

10~23kb包裝蛋白實驗一、技術(shù)路線圖重組噬菌體收集噬菌體液基因組文庫1.GenomicDNA2.LambaDNA

Fig.1electrophoresisofgenomicDNA圖1.基因組DNA電泳1248.5kb

實驗一結(jié)果2.1基因組DNA的提取提取的基因組

DNA大于50kbFig.2DigestionofgenomicDNAbyBclI1.5U/ugDNABclI，2.2.5U/ugDNABclI3.1.25U/ugDNABclI4.LambaDNA/HindⅢMarker圖2.基因組DNABclI酶切電泳23kb9.4kb1234Fig.3Electrophoresisofrecoverproductsof10~23kbDNAfragments

1.BclI酶切純化片段2.LambaDNA/HindⅢMarker圖3.10~23kbDNA片段回收產(chǎn)物電泳23kb9.4kb

12

實驗一結(jié)果2.2家蠅基因組DNA酶切和純化純化了10~23kb的BclI酶切DNA片段實驗二、家蠅卵黃蛋白基因組基因的克隆和序列分析

特異性探針噬菌斑原位雜交鑒定可疑陽性克隆亞克隆文庫液轉(zhuǎn)化KW251噬菌斑三次純化噬菌斑原位雜交λ-DNA

提取

陽性克隆單酶切和雙酶切SouthernBlotHindIIIXhoI目的DNA片段測序序列分析實驗二、技術(shù)路線實驗二結(jié)果GCTCCCGGCCGCCATGGCCGCGGGATCGAACAAGAAGTCACCGTTTTCATCACCGGTCTGCCCCAGTCCTTGGAGGATGTGAAAAAGGCCAACACCAAATTGATCCAGTCCTACATTCAACGTTACAGCAAAAAACCCGAAGCACCCCAGGGTGAGGATCAATCGAAATGGGAAAATGAAAAACCTGTGGGCGGTCATTTGGTTGTCATCGATTTGGGCCATGCCATCACCAATGTGGAACGTTATGCCACTTTGAATGTCAAGGAGACCGGTAAAATGATTGGCAAGACCTTGGCCGAGTTGGAGAGGGAAAGCAATGTCGATTTGGAAGATCTCCATGTCATTGGTCAGGGTATTGGTGCCAATGTTGCCGGTGCTGCTGGTAAGGCTTTCAAGGACATTACCACCCACAAATTGGATCGCATTACTGCCTTGGACCCTGCCAGCCAAATGGCCAAGGATCCCAAAGTTTTGACCGGTTTGTCTCGTGGCAGTGCCAAATTCGTTGATGCCATCCACACCTCCGCCTTGGGTATGGGCACCACCCGTCGTGTTGGTGATGTTGATTTCTTCCCCAATGGACCATGCCAAGGTGTTCCCGGTAGCCGCAATGCCATCGATGCCCAAGCTCGTGCCACACGTCTCTTTGCCGAAACAGTTCGTCCCGGTAACAGCCGCAATTTCCCTGCCGTTGAGGCCAGCTCTTTGAAACAGTACCGCAACAATGATGGCTATGGCAAACGCACCTACATGGGCATTGCCACCCATCGTGACATCTCCGGTGACTACATGTTGGAGGTTAAATCACTAGTGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGC卵黃蛋白基因部分DNA片段特異性探針序列2.1特異性探針制備

制備了大小為768bp的地高辛標記的DNA片段特異性探針，工作濃度為1：2000。實驗二結(jié)果2.2陽性克隆的篩選和純化1#positiveclone（about2000plaques/plate）Fig.3Screeningresultof1stroundsituhybridization圖3第一次噬菌斑原位雜交篩選結(jié)果YP1

2#positiveclone（about200plaques/plate）Fig.4Screeningresultof2ndroundsituhybridization圖4第二次噬菌斑原位雜交篩選結(jié)果Numbers：11positiveclone（11plaques/plate）Fig.5Screeningresultof3rdroundsituhybridization圖5第三次噬菌斑原位雜交篩選結(jié)果獲得了含家蠅卵黃蛋白基因的陽性克隆2.02.3

4.46.6

9.4231.4

1.6

2.0

3.5

4.3

5.0

21

123456

kbkbFig.6Digestionanalysisofrecombinantλ-DNAofpositiveplaque圖6陽性克隆λ-DNA的酶切分析實驗二結(jié)果2.3mdYP基因組基因的克隆1:LambdaDNA/HindⅢMarker2:XhoⅠ,3:XhoⅠ/HindⅢ,4:HindⅢ,5:SalⅠ6:λDNA/EcoRⅠ+HindⅢMarker3.5

kb1241:XhoI，2:HindⅢ3:XhoⅠ/HindⅢFig.7Southernblotofrecombinantλ-DNAofpositiveplaquewithmdYP1DNAprobeDIG-labeled圖7陽性克隆λ-DNA的Southernblot實驗二結(jié)果2.3mdYP基因組基因的克隆1ACAGAATTTGCTATTTAGGTCTTATATTTCTCAGAGCAAAGAGCTGGGCTGCAGAGAGATTTATGACAACGCCGTTGTGTGGTGTATGTATATAGAAAGA100101ATAGAAGAATTACTTTNCTTAGTTGTTTTTTAAATAATCCTGTCCAACAAATGTGTCCAATCCAATTCTTGTTTTATTGGTTTTATCCCTCCTTAATATT200201AATCTTTTTGGTCTTATTGAATAATTATTGATTGTGGTGATTGCTGTCTCTACTTCGTTTGGTTTGGTTTGGTTGTCAGTTGCGAACGTTGGAAACAAAA300301ATGAAAAACGTCCCAACGAAACGAATATGAAGGCCACAAAGGAATACCCGATAAAAAATAAACAGAAAGCAAAGACTCCGGGTACTCTGTTGTTTACGAA400401TGAGACATGAGAGAATTGAACATCTTCACTAAAGAGCTCGGAATTAGTTACAAATTAAATTGAATTCGACGGTGCGGTGGCGACATGACAGACGGACGGGT500501TGATGGATAGATAACGGCGTTGAGAGTGAATGTGTTGGCGTCTTGTCTCTATTGCAGGGTGATTCATATATTAGAAAATTTACAATGGAAAAGTGGTTAT600601TTTAAATAAGAAATAATATATATATGATATATATGATGTTTGGGGAAAAAATATGAAAAGATTACACTCTTACCTCATTATCTTTACTAAAAAAGGTATT700701TTATGTATAAAAGGCTTGCAAAGTCGAAGTCTATTCACAAAAGATTCGAAAACGGTAATAAATGATCCTTCAGCAAAATATTATTGGACAGTATTGGACA800801ATTCAACGATAAAAAAGTCACATTAAAAAGTGCTTTAAAAATAATGGCGGTTGACTTTTTTGCAGTTTTTTTTTTATCTTACCCTTTATGTCTAAAACGG900901ACATTTTCAAAGGAACCTTATTCTAAAAATCTCAAAATATATGGAAGAGGGGGTAACTTTCCTCCTCTATTTAGGTTACTTTCCGATGTAAATTTTCAAA10001001ACGCCATTACATTTGTCTTCTATTTTTAGCCCTACTTTCATAATCTACTAGATTATTTCAGTATTTTTTTGCACAGTGCAGGTGATGATATTGGATAATT11001101CTTATTGAGGAAAAAATTCCCCAGTAAGAATGGAGAATCGGGTTATGAAACAAGATTTTTTAATAATTTCATTAATTATTTATTTTTTGNTTCTATGATT12001201TTGTGTTTTTTTTTTTTTTTGAATATTATTTTGAAATAAAGTGAAATCGAAATCTTCTCCTTTTTAGGTTATTGATCTAAAATACAAGGCTATTGCCAAA13001301ATCATGTAATACAATATTTGCTGAAATAGGCCAAATCACTTCTCGCCCTCCGTTCTATTTTTGATGACAGTGAAGCATTATGCAAGCTTGTTTCAATTCT14001401CCCGCTTATCGTCACAACCTCTACAGATTTTGCAATTTACGTAAAGAAAAAGAAAAACGGCAAAATATTGAAAATGAAAATCAGCAAAAATCAAAAAAAT15001501TATCAGCAGTTCTCGCTGGACTCACCTGACGGTCTGATTAACTATTTTGCTGTGAAATGTTAAATTTATTTGATATAAATACCCCCAGTGGAAGCCAGTG16001601GAGGGTACATTTCACAAGTTAGAACATTCGGCTTAAGAAGTGCCCGTACGACTTTGGGAATTTTTGAAACTGACCGACAGAAGGATGAATCCATTGGGAG17001701TTTTGTGCTTTGTAGCCTTTGTGGCTGCCGGCGCCTTGGCCTCACAATCGCAGGACTACAGTCCAAAGCCAGCACATTGGCTGAAACCCACCGAATTGGA18001801GGCCACACCATCTTTGAATGAGCTCACCTTTGAGCAGCTGGAGAATATGCCATTGGAAAAGGGAGCCAAATTGATGCGTAAACTCTGTAAGTAGCCAGTC19001901AAGAATTTGGAAAAGACCTCCAATAATACAATTTCTCTCTTCTCTAGACCACCTGTCCCAAATCGACTACTCTGTGTCGCCCAACTTTGTGCCCAGTCCC20002001AGCAATGTCCCCGTCTACATTTTCAACAGCAAGGGTGAAAAAGAAACCTGCAACTTGAACAACTACGTCGACATTGCCAAGGAAAAGCCGAAATTTGGCG2100獲得了全長3991bp的基因組序列，包含1.7kb卵黃蛋白基因組基因及其5’-調(diào)控區(qū)序列。2101AACAAGAAGTCACCGTTTTCATCACCGGTCTGCCCCAGTCCTTGGAGGATGTGAAAAAGGCCAACACCAAATTGATCCAGTCCTACATTCAACGTTACAG22002201CAAAAAACCCGAAGCACCCCAGGGTGAGGATCAATCGAAATGGGAAAATGAAAAACCTGTGGGCGGTCATTTGGTTGTCATCGATTTGGGCCATGCCATC23002301ACCAATGTGGAACGTTATGCCACTTTGAATGTCAAGGAGACCGGTAAAATGATTGGCAAGACCTTGGCTGAGTTGGAGAGGGAAAGCAATGTCGATTTGG24002401AAGATCTCCATGTCATTGGTCAGGGTATTGGTGCCAATGTTGCCGGTGCTGCTGGTAAGGCTTTCAAGGACATTACCACCCACAAATTGGATCGCATTAC25002501TGCCTTGGACCCTGCCAGCCAAATGGCCAAGGATCCCAAAGTTTTGACCGGTTTGTCTCGTGGCAGTGCCAAATTCGTTGATGCCATCCACACCTCCGCC26002601TTGGGTATGGGCACCACCCGTCGTGTTGGTGATGTTGATTTCTTCCCCAATGGACCATGCCAAGGTGTTCCCGGTAGCCGCAATGCCATCGATGCCCAAG27002701CTCGTGCCACACGTCTCTTTGCCGAAACAGTTCGTCCCGGTAACAGCCGCAATTTCCCTGCCGTTGAGGCCAGCTCTTTGAAACAGTACCGCAACAATGA28002801TGGCTATGGCAAACGCACCTACATGGGCATTGCCACCCATCGTGACATCTCCGGTGACTACATGTTGGAGGTCAACGCCGAGAGCCCCTATGGCAAGAGA29002901ACTCCCGCCCGCAAACAAAAATCATACCATGGTGTTCATCAAACTTCCTATGCCAAAAGCAACGAAAACTATTAGAACGTTGGATGTTTGGCAAAAGAAA30003001AAGATTCTTTGGAAATGACTCCGAAAAAATTAAGCTGTGAATATTTGTCGAACGAAAACAGAAAAAAAAAACATCGAAGATAAATTATTGATTATTTAAT31003101TAAAAAAAAAAAAAAAAATAAGACTCTGAACATTACAAAAAGGAAATATTTATTTGAATTTTTATTCTTAGAGGATCGGGCGGGATAAACAAGATTATTA32003201AAGAAGGGCTAAAAATATAAGACAAGTGCGTCGGCGTTTTGAAAATGTACATGGCAAAGTAACCTAAATAGAGGCGCAAAGTTCCTCCTCTTCCCCATTT33003301TTAGAAATTTCGTTTCATAATATGTACAGGGTGAGATAAAAAAAAACTGCAACAAAGTCAAACGCTATAATTTTTATTTTTTTTTTAATTTTATTTATTG34003401AAAGCAAAAAATGTCGGAAATAGCATCAAATTTTAGAATATATTTAGTGTACAAGTTCCAATACCGTCGTATGGACTTGTTGTGGTTCAAATTCTACTGA35003501GTAGATTTTGAGCCGGAATTTATTGTTGCACAAAGACGAACAACAATATTGTTTAGCAAACTACAAACAAACACAAAAGTATTCTGACGATACTTACGTT36003601TGTTGTCTGCACAAAAGAAAAAGCACTTTAATAATTAGTATTTCAAAGTTGAAAATGACTCAGTCGGTCAAATTTTTATTTTATAAAAAAATTCACAATT37003701TTGATCTGGCGATCCACTTTTCTGAACTTCAAGAAGAAGAGTGCCGTTTTTAGTTTTGTGACGACATCGATAGTTTTTATTTATCGAGATCGATTAGATC38003801CATGTCGATGTCGTCATCTATCGGGTTGGGTCTATTCCCAACATGCCGGGCCCCTTGCACTGGTGCACAGTTAATGCCGTTGCTATTTTTTCAAGCACGC39003901TCAGGAACCTGTCCATCATCTCTGGCTGCTGCATTAAGGACTTTCCTTCGGGTTTTAATTCGGGCTGTTGTGCGGTATGTCGACTTTGTTG3991Fig.3ThesequenceofMuscadomesticaYP1genecontaining1.7kb5’flankingregion.Theintronregion(1886∽1947)ismarkedbyunderlining,theTATAboxortheAATAAsignalisinbold,ThetranslationinitiationcodonATGortranslationterminationcodonTAGisindicatedbyanopenbox。圖3.卵黃蛋白基因組基因全序列實驗三、家蠅卵黃蛋白基因啟動子片段的克隆與功能分析

FP1RP1或RP2PCRFP2FP3P2P3+75’3’ATG+1啟動子區(qū)FP4P4P1實驗三、技術(shù)路線圖補平T4Ligase表達質(zhì)粒構(gòu)建表達質(zhì)粒構(gòu)建TATAHindIIIP2P3TATAHindIIIHindIII酶切P5P6補平T4Ligase鑒定電轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)染pMYP1-GFPpMYP2-GFPpMYP3-GFPpMYP4-GFPpMYP5-GFPpMYP6-GFP轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細胞BHK-21細胞家蠅卵綠色熒光蛋白啟動子活性熒光顯微鏡熒光顯微鏡2.2啟動子片段的轉(zhuǎn)錄活性鑒定pMYP2-GFP質(zhì)粒電轉(zhuǎn)移結(jié)果pMYP3-GFP質(zhì)粒電轉(zhuǎn)移結(jié)果pMYP4-GFP質(zhì)粒電轉(zhuǎn)移結(jié)果TEbuffer電轉(zhuǎn)移結(jié)果

實驗三結(jié)果家蠅早期胚胎轉(zhuǎn)基因前后的

差異表達研究2.DD-PCR技術(shù)5’N’M’AAAAAAAAAAAAAn細胞總RNA或poly(A)RNA

5’N’M’AAAAAAAAAAAAAncDNA3’NMTTTTTTTTTTTT簡并錨定引物

進行PCR

隨機十聚體NNNNNNNNNN——————————————————————NMTTTTTTTTTTTT持續(xù)循環(huán)

NNNNNNNNNN————————————

——————————NMTTTTTTTTTTTT

變性聚丙烯酰胺凝膠電泳樣品A樣品B作Northern探針作cDNA文庫篩選探針作亞克隆和測序樣品反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)切取目的帶,重新擴增,回收純化

圖3.家蠅早期胚胎轉(zhuǎn)基因前后DD-PCR結(jié)果

1、3、5．轉(zhuǎn)基因處理組T11MA-AP1、T11MA-AP3、T11MA-AP42、4、6．對照組T11A-AP1、T11MA-AP3、T11MA-AP4

圖4.差異片段的二次PCR回收結(jié)果

1．DD-frag-62．DD-frag-53．DD-frag-3M．DL2000Marker

DD-frag-3：355nt

GGTACTCCAGTACAACTGATATCGTATGTTGAAATTCCTGCCGTGAGCAAAGCTCCCTTTGTAATAATCAGTACCCAAGAACAGGCAAACAAATAAATAACAGTTCTAAGTGAAATAACTGATGATCTACTATACAAAACTTATAAAGAGATAATAAGGTATTCGGTAATAAAATAAAAAAATAGTAAAGGTGGGTTCTTACTAATTATTCATTCAATAATAATAATCGAATGTATTACTGCTCCCTAAATCAACTAAACAGTTCTAATAGAGTTGAGGGAATGCATGCAGTAATATTCCTGTTGTAAAATTGAATGAAGCTCCAAACCTGTTCCAATGCAGGAGTATATCTGGA

DD-frag-5：432nt

GCAATCGATGTACGATGTTTAACAACAACAAGAGTAATTACACTTTCAATTTTCACTTGTCTAACCAAAATTCATGTTGTATGAATGTCAAAAAGAAAAGACGACGGGTAACAAAAATCGAAAGTGAGCAACAATCGATTCTGGTGACGACAAAATTCTTAAGCAAGAAATCATCATCTTAAGAACGAAACAACTCATTGACCTAGAATGTTGATTGACAACTTAATGCTTCACCACTAGACATTACTCGTCAGCTGGTTACATCGATTGTTAAACGTTTTCAAATCGAAACACTAGAAGATGGATAACCCGTGATTGGCTTTTCGTATTAAAGATAGATGTAAATCAACCGCGAATTGTTCAACAACAACCAAGCAAAGGAATCAACTGAACACATATCAAAGAGTGTTTGGCACTTTATATAAATACTTDD-frag-6：240ntGCAATCGATGTCACGATCGTAAGCGTTAACCAAAATTGCGTCCTCTAGAGATAGTATTCAACAAGCGATAATGGCCGTACTGAGGCAAATCTTTGTCATTCCCAAAAGTATGTTTCAGAAGCACCTTGGTAATAGTGCAAAATATAGGCCTTATTGAATTTTGACGAAATCTCTTTCATGATTTTAGTGCATCGATTGCATACAAACGCTCTTTTGTAAGCCAAGACATAGTTTCTCCA圖8DD-frag-3（上）、DD-frag-5（A）與DD-frag-6（B）點雜交鑒定結(jié)果

1．陽性對照2.陰性對照3.家蠅基因組1．陰性對照;2.家蠅基因組;3．轉(zhuǎn)基因處理組;4.對照組

三、重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

1.工具酶：限制性內(nèi)切酶