備課素材：限制酶的選擇 第一學(xué)期高中生物學(xué)選擇性必修三

限制酶的選擇先看一道試題：為初步探究某動(dòng)物PHB2蛋白抑制人宮頸癌細(xì)胞增殖的原因，研究者從基因數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取了該蛋白的基因編碼序列(簡(jiǎn)稱phb2基因),大小為0.9kb(1kb=1000堿基對(duì)),利用大腸桿菌表達(dá)該蛋白。圖1為所用載體圖譜示意圖。為使phb2基因(該基因序列不含圖1中限制酶的識(shí)別序列)與載體正確連接，在擴(kuò)增的phb2基因兩端分別引入

和

兩種不同限制酶的識(shí)別序列。答案：PvｕⅡ、

EcoRⅠ重點(diǎn)解析：KpnⅠ在載體上有兩個(gè)切割點(diǎn)，若使用會(huì)導(dǎo)致酶切后形成的重組載體中終止子缺失或啟動(dòng)子和復(fù)制原點(diǎn)同時(shí)缺失，故排除。此題考查了基因工程限制酶的選擇。那么，如何選擇限制酶？限制性核酸內(nèi)切酶是可以識(shí)別并附著特定的核苷酸序列，并對(duì)每條鏈中特定部位的兩個(gè)脫氧核糖核苷酸之間的磷酸二酯鍵進(jìn)行切割的一類酶，簡(jiǎn)稱限制酶。根據(jù)限制酶的結(jié)構(gòu)，輔因子的需求切位與\t"/item/%E9%99%90%E5%88%B6%E6%80%A7%E6%A0%B8%E9%85%B8%E5%86%85%E5%88%87%E9%85%B6/_blank"作用方式，可將限制酶分為三種類型，分別是第一型（TypeI）、第二型（TypeII）及第三型（TypeIII）。Ⅰ型限制性內(nèi)切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性內(nèi)切酶只催化非甲基化的DNA的水解。Ⅲ型限制性內(nèi)切酶同時(shí)具有修飾及認(rèn)知切割的作用。限制性核酸內(nèi)切酶分布極廣，幾乎在所有細(xì)菌的屬、種中都發(fā)現(xiàn)至少一種限制性內(nèi)切酶，多者在一屬中就有幾十種，例如在嗜血桿菌屬中（Haemophilus）現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的就有22種。有的菌株含酶量極低，很難分離定性；然而在有的菌株中，酶含量極高．如E.coli的pMB4(EcoRI酶）和H.aegyptius(HalⅢ酶）就是高產(chǎn)酶菌株。據(jù)報(bào)道從10g的H.aegyptius的細(xì)胞中，能分離提純出可消化10gλ噬菌體DNA的酶量。細(xì)菌是限制性內(nèi)切酶，尤其是特異性非常強(qiáng)的I類限制性內(nèi)切酶的主要來(lái)源。根據(jù)酶的功能特性、大小及反應(yīng)時(shí)所需的輔助因子，限制性內(nèi)切酶可分為兩大類，即I類酶和Ⅱ酶。最早從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的EcoK、EcoB就屬于I類酶。其分子量較大；反應(yīng)過(guò)程中除需Mg2+外，還需要S-腺苷-L甲硫氨酸、ATP；在DNA分子上沒(méi)有特異性的酶解片斷，這是I、Ⅱ類酶之間最明顯的差異。因此，I類酶作為DNA的分析工具價(jià)值不大。Ⅱ類酶有EcoRI、BamHI、HindⅡ、HindⅢ等。其分子量小于105道爾頓；反應(yīng)只需Mg2+；最重要的是在所識(shí)別的特定堿基順序上有特異性的切點(diǎn)，因而DNA分子經(jīng)過(guò)Ⅱ類酶作用后，可產(chǎn)生特異性的酶解片斷，這些片斷可用凝膠電泳法進(jìn)行分離、鑒別。限制性內(nèi)切酶識(shí)別DNA序列中的回文序列。有些酶的切割位點(diǎn)在回文的一側(cè)（如EcoRI、BamHI、Hind等），因而可形成黏性末端，另一些Ⅱ類酶如AluI、BsuRI、BalI、HalⅢ、HPaI、\t"/item/%E9%99%90%E5%88%B6%E6%80%A7%E6%A0%B8%E9%85%B8%E5%86%85%E5%88%87%E9%85%B6/_blank"SmaI等，切割位點(diǎn)在回文序列中間，形成平整末端。AluI的切割位點(diǎn)如下：5'-AG^CT-3'3'-TC^GA-5'在已發(fā)現(xiàn)的限制性內(nèi)切酶中，近百種酶的識(shí)別順序已被測(cè)定。有很多來(lái)源不同的酶有相同的堿基識(shí)別順序，這種酶稱為“異源同功酶”（isochizomer，同切限制內(nèi)切酶；同裂酶）。應(yīng)該注意的是，這些酶雖然有相同的識(shí)別順序，但它們的切點(diǎn)并不完全一樣。例如XmaI和SmaI都識(shí)別六核苷酸CCCGGG，但XmaI的切點(diǎn)在CCCCGGG，而EmaI的切點(diǎn)則在CCCGGGG，前者切割DNA分子，形成帶有CCGG粘性末端的DNA片段，而后者并不形成粘性末端（而叫平末端）。當(dāng)然，也有識(shí)別順序和切點(diǎn)都相同的酶，如HapⅡ、HpaⅡ、MnoI，都在識(shí)別順序CCGG內(nèi)有一相同的切點(diǎn)，HalⅢ和BsuRI同樣在識(shí)別順序GGCC內(nèi)有一相同的切點(diǎn)。酶切位點(diǎn)在目的基因兩側(cè)和載體上必須都存在當(dāng)實(shí)驗(yàn)需要構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，目的基因的序列是不能被破壞的。因此所選限制酶的酶切位點(diǎn)應(yīng)該在目的基因兩側(cè)，而不能位于目的基因內(nèi)部，否則會(huì)將目的基因切斷導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。此外，在載體上同樣需要有一致的酶切位點(diǎn)，使后續(xù)DNA連接能正常進(jìn)行。如果目的基因兩側(cè)無(wú)法形成相應(yīng)序列，可在兩側(cè)添加與載體上酶切位點(diǎn)相匹配的限制酶識(shí)別序列。酶切不能破壞載體的復(fù)制原點(diǎn)、啟動(dòng)子及終止子等特殊序列在構(gòu)建重組載體時(shí)，載體上的復(fù)制原點(diǎn)不能被破壞，否則目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后不能正常進(jìn)行DNA復(fù)制，也難以穩(wěn)定存在。構(gòu)建基因表達(dá)載體的最終目的是使目的基因能夠表達(dá)其遺傳特性，從而發(fā)揮作用，因此，啟動(dòng)子及終止子也不能被剪切破壞。例1、為了成功構(gòu)建重組表達(dá)載體，確保目的基因插入載體中方向正確，最好選用酶切割S基因的cDNA和載體。答案

XbaI

和HindⅢ解析：若選擇BamHI,會(huì)破壞S基因，故排除；若選擇EcoRI,雖然能成功將S基因?qū)胭|(zhì)粒，但可能會(huì)反向接入，使S基因不能正常表達(dá)。S基因所在序列左側(cè)為5'端，右側(cè)為3'端，轉(zhuǎn)錄方向?yàn)閺淖笾劣?。選用XbaI和HindⅢ進(jìn)行雙酶切，能