基于ssr標(biāo)記的野生毛花獼猴桃種質(zhì)資源遺傳多樣性分析

基于ssr標(biāo)記的野生毛花獼猴桃種質(zhì)資源遺傳多樣性分析

杏仁是中國(guó)的一種杏仁精。相對(duì)于龐大的野生種質(zhì)資源,獼猴桃的栽培品種只占了很小的一部分。目前獼猴桃品種選育主要還是通過(guò)從野生資源中選擇或雜交育種(黃宏文等,2000)。豐富的野生獼猴桃種質(zhì)資源是獼猴桃品種選育和產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的基礎(chǔ)(Huangetal.,2004;Ferguson&Huang,2006)。目前商業(yè)化栽培利用的獼猴桃主要是美味獼猴桃和中華獼猴桃(劉磊等,2013),而毛花獼猴桃(ActinidiaerianthaBenth.)多處于野生狀態(tài),生產(chǎn)實(shí)踐中推廣應(yīng)用的毛花獼猴桃品種極少(張佳佳等,2011)。毛花獼猴桃果實(shí)AsA含量較高(5.00~13.79mg·g-1FW),是中華獼猴桃的3~4倍(鐘彩虹等,2011)。毛花獼猴桃作為中國(guó)特有的野生種質(zhì),廣泛分布于云南、廣西、貴州、湖南、江西、福建和浙江。通過(guò)對(duì)野生毛花獼猴桃種質(zhì)資源進(jìn)行果實(shí)表型性狀及SSR遺傳多樣性分析的研究,可了解其種內(nèi)的遺傳背景,選擇優(yōu)良的育種親本材料,提高育種效益。Weising等(1996)研究發(fā)現(xiàn)二倍體中華獼猴桃的大多數(shù)SSR位點(diǎn)擁有較高的雜合度。Huang等(1998)用20個(gè)SSR位點(diǎn)研究發(fā)現(xiàn)二倍體和四倍體中華獼猴桃表現(xiàn)出很高的雜合度,在DNA水平上的多倍體獼猴桃具有更豐富的多樣性。Cipriani等(2002)用SSR標(biāo)記在對(duì)獼猴桃進(jìn)行遺傳圖譜構(gòu)建時(shí)尋找到了控制果實(shí)質(zhì)量的數(shù)量性狀位點(diǎn)連鎖的標(biāo)記。Tsetolin等(1997)采用“假測(cè)交”的作圖技術(shù),挑選中華獼猴桃和硬齒獼猴桃雜交后代對(duì)251個(gè)標(biāo)記進(jìn)行篩選,獲得了105個(gè)SSR位點(diǎn),應(yīng)用SSR和RFLP標(biāo)記構(gòu)建了獼猴桃遺傳連鎖圖譜。本研究中通過(guò)對(duì)江西武功山境內(nèi)的野生毛花獼猴桃進(jìn)行實(shí)地調(diào)查和資源收集,在對(duì)果實(shí)表型性狀分析的基礎(chǔ)上,采用SSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)野生毛花獼猴桃進(jìn)行遺傳多樣性分析,旨為其優(yōu)異基因發(fā)掘利用和野生株選優(yōu)及其遺傳育種工作提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1幼葉和果實(shí)的測(cè)定2012年7—8月對(duì)江西省武功山境內(nèi)的野生毛花獼猴桃種質(zhì)資源進(jìn)行了普查,供試材料為隨機(jī)采集的70份野生毛花獼猴桃種質(zhì)的幼葉和果實(shí),用冰盒保存并運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,置于–20℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。每份毛花獼猴桃種質(zhì)隨機(jī)選取10個(gè)果實(shí),根據(jù)UPOV(國(guó)際植物新品種保護(hù)聯(lián)盟)公布的獼猴桃屬品種測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)(UPOV,2012)對(duì)果實(shí)的8個(gè)表型性狀(表1)進(jìn)行測(cè)定和評(píng)價(jià)。所有的表型性狀的測(cè)定結(jié)果按照UPOV標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類(lèi)和采用NTSYS-pc2.1進(jìn)行賦值轉(zhuǎn)換成表型數(shù)據(jù)矩陣。1.2毛花獼猴桃基因組中ssr擴(kuò)增和擴(kuò)增采用CTAB法提取樣品幼葉基因組DNA,用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA質(zhì)量和濃度,–20℃保存?zhèn)溆谩⒄誘estolin等(2001)構(gòu)建的獼猴桃SSR遺傳連鎖圖譜,選用廣泛分布于中華獼猴桃基因組中的70對(duì)SRR引物(Palombi&Damiano,2002;Zhengetal.,2004;Korkovelosetal.,2008),首先隨機(jī)選擇8份野生毛花獼猴桃種質(zhì)材料進(jìn)行擴(kuò)增,篩選出多態(tài)性較好的21對(duì)SSR引物,再對(duì)70份野生毛花獼猴桃種質(zhì)資源進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min;94℃變性45s,50~60℃退火45s,72℃延伸45s,30個(gè)循環(huán);72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物10%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè),快速銀染法染色。1.3同遷移率的統(tǒng)計(jì)對(duì)果實(shí)表型性狀賦值后,采用Excel2007進(jìn)行頻率分析。根據(jù)SSR分析的結(jié)果,將每條SSR引物擴(kuò)增出的每一條帶視為1個(gè)位點(diǎn),相同遷移率的記為1,無(wú)條帶的記為0,統(tǒng)計(jì)等位位點(diǎn)數(shù)、多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)和多態(tài)性信息含量(PIC)參數(shù)值,不具多態(tài)性的條帶不予統(tǒng)計(jì)。采用NTSYS-pc2.1軟件計(jì)算野生毛花獼猴桃的遺傳距離并按照非加權(quán)配對(duì)平均法(UPGMA)和SHAN程序進(jìn)行聚類(lèi)分析,并對(duì)聚類(lèi)分析得到的果實(shí)表型性狀歐式距離矩陣和SSR標(biāo)記遺傳距離矩陣進(jìn)行Mantel相關(guān)性檢測(cè)(Lapointe&Legendre,1992)。2結(jié)果與分析2.1不同品種毛花獼猴桃結(jié)果特性聚類(lèi)分析調(diào)查結(jié)果(表1)表明,70份野生毛花獼猴桃的果實(shí)形狀變化豐富,果實(shí)形狀以圓柱形居多(49%),其次為橢圓形(37%)和圓形(14%);果心橫截面有圓形、扁圓形和橫向橢圓形,所占比例分別為27%、32%和41%;果實(shí)橫截面以圓形居多(61%),扁圓形和橫向橢圓形所占比例分別為23%和16%;果基形狀以微傾斜(74%)為主,果實(shí)傾斜則占26%;果頂形狀除了圓形所占比例為41%外,其它微凸和深凸所占比例分別為37%和22%;毛被顏色為白色和棕色,各占50%。根據(jù)果實(shí)的表型性狀對(duì)野生毛花獼猴桃進(jìn)行UPGMA聚類(lèi)分析,70份野生毛花獼猴桃資源分為3個(gè)組(圖1)。A組屬于果實(shí)圓形和橢圓形混合組,果基形狀微傾斜,毛被白色和棕色混合分布。A組又可以分為兩個(gè)亞組:A-1亞組果實(shí)橫徑寬,縱徑短,果心橫截面橢圓形,果實(shí)橫截面扁圓或橢圓形,果頂圓形;A-2亞組果實(shí)的橫徑中等或窄,縱徑中等,果心橫截面圓形或扁圓形,果實(shí)橫截面圓形,果頂微凸。B組果實(shí)橢圓形,縱徑短,果頂微凸,毛被為白色。C組果實(shí)圓柱形,果實(shí)的縱徑長(zhǎng),果心橫截面橢圓形,果基性狀傾斜,果頂深凸,毛被白色和棕色混合分布。C組又分為兩個(gè)亞組:C-1亞組果實(shí)的橫徑中等,果實(shí)橫截面圓形;C-2亞組果實(shí)橫徑窄,果實(shí)橫截面扁圓。2.2ssr引物擴(kuò)增多態(tài)性利用所選擇的70對(duì)SSR引物對(duì)野生毛花獼猴桃種質(zhì)進(jìn)行分析,共篩選出21對(duì)多態(tài)性高的SSR引物,通過(guò)對(duì)70份野生毛花獼猴桃種質(zhì)群體的擴(kuò)增,并對(duì)等位位點(diǎn)數(shù)、多態(tài)位點(diǎn)數(shù)以及多態(tài)性信息含量(PIC)等進(jìn)行多樣性統(tǒng)計(jì)(表2)。兩對(duì)SSR引物擴(kuò)增得到的基因片度長(zhǎng)度在75~400bp,PCR總擴(kuò)增總計(jì)得到127個(gè)等位位點(diǎn),等位位點(diǎn)數(shù)在2~12之間,平均每對(duì)SSR引物可以檢測(cè)到6.04個(gè)等位位點(diǎn)數(shù)。其中多態(tài)性位點(diǎn)最豐富的是引物UDK96-040,有12個(gè)等位位點(diǎn)變異,而引物UDK97-401只檢測(cè)到了兩個(gè)等位位點(diǎn)變異。多態(tài)信息含量(PIC值)變化范圍為0.358~0.837,平均為0.691。2.3種質(zhì)聚類(lèi)分析通過(guò)21對(duì)多態(tài)性SSR引物分析,70份野生毛花獼猴桃種質(zhì)材料的遺傳相似系數(shù)(GS)變異范圍為0.5306~0.9252,平均值為0.7805。其中種質(zhì)66和68、種質(zhì)45和53的GS值最大(0.9252),表明兩者的親緣關(guān)系很近,而種質(zhì)25和47的GS值最小,說(shuō)明兩者的親緣關(guān)系最遠(yuǎn),兩者的相似性只有為0.5306。根據(jù)材料間的遺傳相似系數(shù),采用UPGMA法對(duì)野生毛花獼猴桃種質(zhì)進(jìn)行聚類(lèi)分析(圖2),利用21對(duì)SSR標(biāo)記能將70份野生毛花獼猴桃種質(zhì)相互區(qū)分,在GS值在0.65水平上將所有的材料劃分成Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ共3個(gè)組。Ⅰ組包括了27份種質(zhì)材料,包含了全部10份果實(shí)圓形的種質(zhì)和17份的果實(shí)橢圓形的種質(zhì)。Ⅱ組包括19份種質(zhì)材料,果實(shí)形狀主要為橢圓形,但也包括了5份的圓柱形的種質(zhì)材料。Ⅲ組則包括了24份種質(zhì)材料,種質(zhì)的果實(shí)形狀主要為圓柱形,同時(shí)也聚集了3份橢圓形的種質(zhì)材料。圓形、橢圓形和圓柱形果實(shí)的種質(zhì)都有各自聚類(lèi)的趨勢(shì),但三者之間并沒(méi)有完全分開(kāi)。2.4線(xiàn)性關(guān)系分析結(jié)果為了解野生毛花獼猴桃果實(shí)表型性狀的遺傳多樣性和SSR分子標(biāo)記之間可能存在的內(nèi)在聯(lián)系,將野生毛花獼猴桃果實(shí)表型性狀歐式距離矩陣和SSR標(biāo)記遺傳距離矩陣進(jìn)行Mantel相關(guān)性分析,結(jié)果表明二者相關(guān)性達(dá)到極顯著水平(r=0.814,P<0.01),兩種分析方法得出的結(jié)果具有很大程度的吻合性。野生毛花獼猴桃不同單株之間在SSR標(biāo)記遺傳距離矩陣中親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近與果實(shí)表型性狀變異的程度大致吻合,果實(shí)表型性狀歐式距離矩陣中相距較近的單株之間其遺傳距離也相對(duì)較小。3討論3.1不同品種、不同表型性狀下毛花獼猴桃生長(zhǎng)情況近年來(lái),對(duì)野生植物的遺傳多樣性和核心種質(zhì)的研究是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)問(wèn)題(馬玉敏等,2008)。通過(guò)對(duì)野生居群的表型性狀的調(diào)查和研究,不僅可以對(duì)野生資源進(jìn)行科學(xué)有效地保護(hù)和合理地開(kāi)發(fā)利用提供指導(dǎo)意義,而且還可以為推動(dòng)保護(hù)生物學(xué)和遺傳育種提供重要的理論基礎(chǔ)。雖然野生毛花獼猴桃在中國(guó)多個(gè)省份有分布,但大多數(shù)是出于零星分布的狀態(tài),再加上人為的因素,毛花獼猴桃資源破壞很?chē)?yán)重。本研究中對(duì)江西省武功山境內(nèi)的野生毛花獼猴桃居群進(jìn)行實(shí)地調(diào)查中發(fā)現(xiàn),70份野生毛花獼猴桃種質(zhì)資源集中分布在(N27°32′14′′,E114°07′22′′)至(N27°32′52′′,E114°07′47′′)之間,分布較集中,超出這一范圍則所發(fā)現(xiàn)的野生毛花獼猴桃極少,基本處于零星分布狀態(tài)。在獼猴桃種質(zhì)資源進(jìn)行評(píng)價(jià)和遺傳育種工作中,果實(shí)的表型性狀是一類(lèi)十分重要的評(píng)價(jià)指標(biāo)(黃宏文等,2000)。通過(guò)對(duì)收集的70份野生毛花獼猴桃果實(shí)表型性狀的研究,發(fā)現(xiàn)毛花獼猴桃在野生狀態(tài)下存在豐富的表型性狀遺傳多樣性,如在果實(shí)形狀、果實(shí)橫徑、果實(shí)縱徑、果心及果實(shí)橫截面形狀、果基及果頂形狀以及毛被的顏色等性狀上都表現(xiàn)出了很高的多樣性和差異性。同時(shí),豐富的表型性狀遺傳多樣性也為野生毛花獼猴桃的品種選育和遺傳育種的親本選擇提供豐富的種質(zhì)資源。因此,在對(duì)野生毛花獼猴桃資源進(jìn)行野生選優(yōu)工作中,發(fā)現(xiàn)具有優(yōu)良的果實(shí)表型性狀的單株,從中培育出適應(yīng)性和抗性強(qiáng)、果實(shí)表型性狀優(yōu)良的毛花獼猴桃品種是今后研究工作的重點(diǎn)方向。3.2毛花獼猴桃ssr分子標(biāo)記分析選擇優(yōu)良性狀的親本材料是進(jìn)行獼猴桃育種工作的前提和基礎(chǔ),親本材料遺傳背景狹窄則會(huì)導(dǎo)致難以培育出優(yōu)良性狀的品種。因此,通過(guò)選擇優(yōu)良性狀的親本材料,比較材料間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近,對(duì)于獼猴桃新品種的選育和品種改良工作具有重要的生產(chǎn)指導(dǎo)意義。利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行獼猴桃遺傳多樣性的研究,國(guó)內(nèi)外已有相關(guān)報(bào)道。鄭軼琦等(2003)利用9對(duì)SSR引物,對(duì)中國(guó)栽培的48個(gè)獼猴桃品種(品系)進(jìn)行了遺傳多樣性研究,結(jié)果表明中國(guó)獼猴桃栽培品種具有較高的遺傳多樣性,SSR標(biāo)記在獼猴桃品種中有較高鑒定效率;栗琪等(2004)對(duì)中華獼猴桃(A.chinensis)和美味獼猴桃(A.deliciosa)的9個(gè)天然居群的遺傳多樣性進(jìn)行了初步分析,通過(guò)對(duì)14對(duì)獼猴桃引物的篩選,8對(duì)重現(xiàn)性好的引物擴(kuò)增結(jié)果表現(xiàn)出良好的多態(tài)性。Liu等(2010)和劉亞令等(2006)對(duì)毛花獼猴桃自然居群進(jìn)行了SSR分析,結(jié)果表明毛花獼猴桃自然居群的多態(tài)信息含量變化范圍為0.705~0.827。然而,本研究中在對(duì)武功山境內(nèi)的野生毛花獼猴桃SSR遺傳多樣性分析時(shí),70份種質(zhì)資源材料的多態(tài)信息含量變化范圍為0.358~0.837。造成武功山境內(nèi)自然居群遺傳多樣性含量變化范圍不同的原因除了本身的群體結(jié)構(gòu)差異之外,可能主要是由于隨機(jī)選擇SSR位點(diǎn)的所帶來(lái)的影響(劉亞令等,2008)。雖然所收集的70份野生毛花獼猴桃種質(zhì)資源為一個(gè)野生居群,各個(gè)單株都分布在很近的地域范圍,同處在相同或相近的氣候和地域環(huán)境條件下,野生毛花獼猴桃單株之間具有一定的親緣關(guān)系,但各自遺傳背景的卻存在一定的多樣性。因此,通過(guò)SSR分子標(biāo)記分析野生毛花獼猴桃種質(zhì)資源遺傳多樣性,可為野生毛花獼猴桃居群優(yōu)良單株的選擇在分子水平上提供了依據(jù)。野生毛花獼猴桃資源開(kāi)發(fā)與利用工作重點(diǎn)是應(yīng)該結(jié)合毛花獼猴桃具有高AsA含量的特性,發(fā)掘與其相關(guān)的SSR標(biāo)記位點(diǎn)(湯佳樂(lè)等,2014),揭示野生毛花獼猴桃AsA富集的分子特征,并有效地促進(jìn)改良獼猴桃果實(shí)品質(zhì)性狀與種質(zhì)創(chuàng)新。3.3ssr聚類(lèi)分析歲立云等(2013)在對(duì)中華獼猴桃和美味獼猴桃紅肉類(lèi)型獼猴桃調(diào)查研究中發(fā)現(xiàn)兩種獼猴桃親緣關(guān)系較近,有按地理來(lái)源優(yōu)先聚類(lèi)的趨勢(shì),且果實(shí)性狀數(shù)據(jù)和AFLP數(shù)據(jù)之間具有極顯著的相關(guān)性。本研究中通過(guò)對(duì)70份野生毛花獼猴桃種質(zhì)資源基于遺傳距離的聚類(lèi)分析,GS值在0.65水平上將所有的材料劃分成Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ3個(gè)組,說(shuō)