第七節(jié)核酸分子雜交課件

第七節(jié)核酸分子雜交（molecularhybridization)特點(diǎn)：靈敏度高（<1pg互補(bǔ)序列）速度快（<24h）簡單易行應(yīng)用：基因克隆的篩選酶切圖譜制作基因組中特定基因序列的定量和定性檢測基因突變分析疾病的診斷、微生物病原體檢測

用標(biāo)記的已知DNA或RNA片段（探針）來檢測樣品中未知核酸序列，通過核苷酸間堿基互補(bǔ)的原則發(fā)生異源性結(jié)合，再經(jīng)顯影或顯色的方法，將結(jié)合核酸序列的位置或大小顯示出來。待測的核酸序列，可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因組DNA和組織細(xì)胞的RNA。

核酸分子雜交

核酸分子雜交↓

固相雜交液相雜交印跡雜交原位雜交

核酸分子雜交的分類一、核酸分子雜交的基本原理1、變性：

在某些理化因素的作用下，核酸雙鏈分子堿基對的氫鍵斷裂，疏水作用被破壞，雙鏈螺旋或發(fā)夾結(jié)構(gòu)被拆開，有規(guī)則的空間結(jié)構(gòu)被破壞，形成單鏈分子，稱為核酸的變性。

引起核酸變性的因素：熱、酸、堿、化學(xué)試劑（如：尿素、甲酰胺、甲醛等）。加熱變性是最常用的方法，一般加熱80-100℃數(shù)分鐘即可使核酸分子氫鍵斷裂，雙鏈分開。變性的核酸分子失去了生物活性，同時(shí)理化性質(zhì)也隨之改變，其紫外吸收值（A260）也隨之升高?？捎米贤馕盏淖兓瘉砀橠NA的變性過程。以A260吸收值對應(yīng)溫度作圖，得到DNA的變性曲線或熔解曲線。通常在DNA樣品的分析中，往往選用測量樣品的吸光度來鑒定其濃度和存度，DNA的吸收峰在260nm，蛋白質(zhì)的吸收峰在280nm。純凈的DNAA260/A280比值約為1.8，純凈的RNAA260/A280比值約為2.0。

A260值達(dá)到最大值1/2時(shí)的溫度稱為解鏈溫度或熔解溫度（meltingtemperature,Tm)，此時(shí)50%的DNA分子發(fā)生了變性。Tm與核酸的G、C含量有關(guān)。

Tm=（G+C）%×0.41+69.3Tm也受介質(zhì)中離子強(qiáng)度的影響，離子強(qiáng)度低，熔解溫度也低。2、復(fù)性在適當(dāng)條件下，變性DNA的兩條互補(bǔ)單鏈重新結(jié)合，形成雙鏈的過程稱為復(fù)性。在熱變性后，當(dāng)溫度緩慢冷卻至比Tm值低20-30℃時(shí)，變性的單鏈DNA即可恢復(fù)雙鏈螺旋結(jié)構(gòu)，這樣的復(fù)性又稱為退火。

第一步是兩條單鏈隨機(jī)碰撞形成局部雙鏈，這種局部的雙鏈?zhǔn)菚簳r(shí)的，若周圍的堿基不能配對就會重新解離，一旦找到正確的互補(bǔ)區(qū)，則其局部雙鏈形成核（成核反應(yīng)），然后核兩側(cè)的序列迅速配對，形成完整的雙鏈分子。復(fù)性過程：影響復(fù)性的因素單鏈核酸的起始濃度：反應(yīng)開始時(shí)的總濃度可直接影響單鏈分子碰撞的幾率，濃度越高，復(fù)性越快。核酸鏈長度（分子量）：分子越長，擴(kuò)散越慢，形成配對的難度也大，復(fù)性也慢。核酸分子的復(fù)雜性：復(fù)雜性即核酸分子中不同序列的總長度，復(fù)雜性越高，形成正確配對的難度也越大，復(fù)性越慢。溫度：溫度過高有利于變性；過低則分子運(yùn)動(dòng)減慢，少數(shù)堿基形成的局部雙鏈也不易解離。適宜的復(fù)性溫度是比Tm低25℃。離子強(qiáng)度（鹽濃度）：適當(dāng)?shù)碾x子強(qiáng)度可中和核酸分子上磷酸基團(tuán)所帶的負(fù)電，減少雙鏈間的靜電斥力，有利于復(fù)性。離子強(qiáng)度過高則不利于復(fù)性。3、雜交來源不同的兩條單鏈核酸分子通過堿基互補(bǔ)形成異源雙螺旋分子，稱為核酸分子雜交。雜交可分成：DNA與DNA、RNA與RNA、DNA與RNA之間的雜交。核酸分子雜交技術(shù)：使已知序列的DNA或RNA片段上帶上可檢測的標(biāo)記，可用來檢測樣品中未知的核酸序列。影響核酸分子雜交的因素：探針濃度、長度、復(fù)雜性：探針濃度越高，復(fù)性速度越快。但雙鏈探針濃度過高會增加自我復(fù)性而影響雜交；濃度過高也會增加非特異結(jié)合，使雜交背景增強(qiáng)。探針越長擴(kuò)散速度越慢；復(fù)雜性越高，配對難度也增大。離子強(qiáng)度：高離子強(qiáng)度溶液中，正離子可中和DNA鏈磷酸基團(tuán)的負(fù)電荷，削除相互間的靜電斥力，有利于雜交分子形成。溫度：通常在低于Tm20-25℃的溫度下進(jìn)行雜交。添加劑：硫酸葡聚糖、聚乙二醇、聚丙烯酸等，因其表面可吸附DNA探針，使DNA接觸面增大，而加速雜交反應(yīng)。雜交條件的嚴(yán)謹(jǐn)性：指雜交反應(yīng)體系中，避免非同源性或部分同源性的核酸序列形成雜交復(fù)合物的嚴(yán)格程度。它主要與雜交反應(yīng)的溫度、離子強(qiáng)度和洗膜的溫度有關(guān)。4、預(yù)雜交

為了減少探針與廣泛存在的非互補(bǔ)核酸的非特異性結(jié)合，在雜交前可用封閉物將這些非特異位點(diǎn)封閉。在雜前的這些處理過程稱為預(yù)雜交。常用于預(yù)雜交的封閉物：變性的非特異性DNA：常用鮭魚精子DNA或小牛胸腺DNA。當(dāng)與濾膜一起孵育后，除濾膜上已吸附樣品DNA的區(qū)域外，它們可被吸附到所有其它區(qū)域，使整個(gè)背景覆蓋一層。由于它們與探針無同源性，在雜交反應(yīng)中可大大減少探針的非特異性結(jié)合，使背影清晰。高分子化合物：某些高分子化合物具有封閉膜上非特異位點(diǎn)的能力。一般常用Denhard`t溶液，包括聚乙烯吡咯酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖。二、核酸探針

定義：核酸探針是指能與特定核酸序列發(fā)生特異性互補(bǔ)的已知核酸片段。一般而言，核酸探針帶有特殊的標(biāo)記物。核酸探針的類型：1、寡核苷酸探針

2、基因組DNA探針

3、cDNA探針

4、RNA探針

5、單鏈DNA探針

由實(shí)驗(yàn)者設(shè)計(jì)、經(jīng)核苷酸合成儀合成。目前的合成儀均可合成70-100bp長的寡核苷酸，但一般常用的寡核苷酸針長18-30bp。優(yōu)點(diǎn)：（1）制備方便，實(shí)驗(yàn)者可根據(jù)需要自行設(shè)計(jì)，避免了天然核酸探針存在的高度重復(fù)序列。（2）由于大多數(shù)寡核苷酸探針長度只有15-30bp，其中即使有一個(gè)堿基不配對也會顯著影響影響其熔解溫度。因此它特別適用于基因點(diǎn)突變分析。（3）比活度高，適用于大多數(shù)雜交，如DNA序列測定、Sounthern、Northern原位雜交等。缺點(diǎn)：探針短，與靶序列形成的雜交體穩(wěn)定性差，對雜交及漂洗的溫度、鹽濃度等條件要求高，操作難度大；探針特異性差，背景噪音也大。1、寡核苷酸探針：

利用機(jī)械剪切或限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA制備成一定大小的DNA片段，再將這些片段插入到適當(dāng)?shù)妮d體中，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，構(gòu)建成基因組DNA文庫，進(jìn)而進(jìn)入文庫中篩選出含有目的基因的陽性克隆，經(jīng)擴(kuò)增、提取DNA、酶切及電泳分離，即可得到足夠量的基因片段，經(jīng)適當(dāng)?shù)臉?biāo)記后，即可作為探針使用。PCR方法也可制備DNA探針。在選擇此類探針時(shí)要特別注意真核基因組中存在的高度重復(fù)序列。要盡可能使用基因的編碼順序（外顯子）作為探針，而避免使用內(nèi)含子及其它非編碼順序，否則探針中可能因高度重復(fù)序列存在引起非特異性雜交而出現(xiàn)假陽性。2、基因組DNA探針：3、DNA探針：由mRNA轉(zhuǎn)錄而來，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以mRNA為模板，合成cDNA第一鏈，進(jìn)而合成第二鏈。將合成的cDNA插入到適當(dāng)?shù)妮d體中，構(gòu)建cDNA文庫，然后篩選適當(dāng)?shù)年栃钥寺。龠M(jìn)一步擴(kuò)增、酶切及純化該cDNA片段即可。也可利用反向技術(shù)制備，即以mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，然后加入一對相應(yīng)于目的序列兩端的PCR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再電泳分離、純化，即可得到特定的cDNA片段。優(yōu)點(diǎn)雙鏈探針，長度較長，可與靶序列形成的雜交體穩(wěn)定性、特異性比寡核苷酸探針高，雜交信號強(qiáng)。缺點(diǎn)由于是雙鏈，必須先變性再雜交，在雜交過程中還存在自我復(fù)性現(xiàn)象。

以雙鏈DNA為模板，利用噬菌體依賴于DNA的RNA聚合酶于體外轉(zhuǎn)錄而成。優(yōu)點(diǎn)①RNA/RNA比RNA/DNA雜交體系穩(wěn)定性高。②單鏈，不存在變性和自我復(fù)性。③RNA中不存在高度重復(fù)序列，非特異性雜交少。④雜交后可用RNase將未雜交的游離探針消化掉，從而使本底降低。缺點(diǎn)：RNA容易降解。4、RNA探針：

利用M13噬菌體載體合成。優(yōu)點(diǎn)無自我復(fù)性現(xiàn)象。缺點(diǎn)需再克隆到M13載體中雜交體不如RNA探針穩(wěn)定技術(shù)難度大5、單鏈DNA探針：探針?biāo)鶖y帶的標(biāo)記物應(yīng)具備的條件：標(biāo)記后的探針的分子結(jié)構(gòu)要盡可能與原來的分子結(jié)構(gòu)相同，絕不影響其堿基配對特異性，不影響探針分子的主要理化特性，尤其是雜交特性。標(biāo)記探針的檢測方法簡便、省時(shí)、準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好、靈敏度高。穩(wěn)定性好、環(huán)境污染少、價(jià)廉。常用的探針標(biāo)記物：放射性同位素：

3H、32P、35S、125I等。非放射性同位素：地高辛素、辣根過氧化酶、堿性磷酸酶等。常用的探針標(biāo)記法：1、切口移位(平移)法2、引物延伸法3、末端標(biāo)記法4、體外轉(zhuǎn)錄法引物延伸法四、核酸分子雜交技術(shù)固相雜交：結(jié)合于某種固相支持物上的待測樣品與溶解于雜交液中的探針進(jìn)行的雜交。包括膜上印跡雜交、原位雜交。液相雜交：待測樣品和探針均溶于液體中進(jìn)行雜交反應(yīng)。（一）膜上印跡雜交

將待測核酸序列結(jié)合到一定的支持物上，然后與存在于液相中的核酸探針進(jìn)行雜交的過程稱為膜上印跡雜交。

DNA或RNA↓

電泳分離核酸片段↓

轉(zhuǎn)移至固相支持物（印跡技術(shù)）↓雜交↓洗去未雜交探針↓雜交信號檢測固相支持物的選擇良好的固相支持物應(yīng)具備的條件：具有較強(qiáng)的結(jié)合核酸分子的能力（>10μg/cm2）。與核酸分子結(jié)合后不影響其與探針分子的雜交反應(yīng)。與核酸分子結(jié)合牢固。非特異性吸附少。具有良好的機(jī)械性，柔軟性好、韌性強(qiáng)，便于操作。常用的固相支持物硝酸纖維膜、尼龍膜、PVDF膜等

是目前使用最多的固相支持物，對單鏈DNA具有較強(qiáng)的吸附作用。RNA經(jīng)過一些特殊的變性劑處理后，也易于結(jié)合到此膜上，尤其是在高鹽濃度下，其結(jié)合能力可使80-100μg/cm2吸附的單鏈DNA或RNA在真空干烤后依靠疏水作用而吸附在膜上。

優(yōu)點(diǎn)雜交信號本底較低。

缺點(diǎn)①由于是靠疏水作用結(jié)合DNA，這種結(jié)合并不十分牢固，隨雜交及洗膜過程DNA會慢慢脫離硝纖膜而使雜交信號下降。②對小分子量的DNA片段（<200bp）結(jié)合能力不強(qiáng)。③靠高鹽與DNA結(jié)合，故不適用于電轉(zhuǎn)移。④易破碎。1、硝酸纖維膜：

對單鏈和雙鏈DNA及RNA的結(jié)合能力達(dá)到350-500μg/cm2。對小分子量的核酸片段也有較強(qiáng)的結(jié)合能力。不一定通過真空干烤，只需短時(shí)間紫外線照射，核酸中的部分嘧啶堿即可與膜上帶正電荷的氨基相互交聯(lián)，從而使結(jié)合更加牢固。優(yōu)點(diǎn)吸附力強(qiáng)（共價(jià)結(jié)合）、機(jī)械性能好（不易破碎、可重復(fù)使用）。缺點(diǎn)對蛋白具有高度親和力，不宜使用于非同位素探針；雜交信號的本底也高。2、尼龍膜：

與尼龍膜相似，其疏水性碳氟化合物可加強(qiáng)與核酸中磷酸成分的離子反應(yīng)，而比尼龍膜結(jié)合力更強(qiáng)，且在預(yù)雜交中很容易被封閉。雜交本底低，結(jié)實(shí)耐用，可多次雜交。3、PVDF膜：印跡類型Southern印跡雜交

(Southernblothybridization)Northern印跡雜交

(Northernblothybridization)斑點(diǎn)雜交(dothybridization)反向斑點(diǎn)雜交(reversedothyberidization)菌落或噬菌斑雜交。Southern雜交的用途：進(jìn)行克隆基因的酶切圖譜分析、基因組DNA的定性、定量分析、基因突變分析及限制性片段長度多態(tài)性分析。原理：RNA經(jīng)過變性瓊脂糖凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜或尼龍膜上，經(jīng)過雜交，分析mRNA的大小及含量。應(yīng)用：半定量分析mRNA的含量；確定mRNA分子的大小。方法：提取組織細(xì)胞總RNA→RNA定量→變性膠電泳→轉(zhuǎn)膜→干膜→預(yù)雜交→雜交→洗膜→壓片→洗片→圖像分析Northern雜交

←28S←18SRNA電泳5SrRNA是核糖體大亞單位的組成成分β-1，4糖基轉(zhuǎn)移酶在損傷坐骨神經(jīng)中的表達(dá)菌落雜交（二）原位雜交

用標(biāo)記的已知核酸序列為探針，使其與細(xì)胞組織或切片中核酸進(jìn)行雜交檢測的方法稱為原位雜交。原位雜交的類型：DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA雜交。

原位雜交的步驟：

取材↓組織、細(xì)胞固定↓預(yù)雜交↓雜交↓放射自顯影或免疫酶法顯色↓觀察結(jié)果

NGFmRNA在小鼠頜下腺中的表達(dá)NGFmRNA在鉛中毒小鼠頜下腺中的表達(dá)低溫冷凍離心機(jī)低溫冷凍離心機(jī)同位素檢測儀雜交爐凝膠圖象分析儀低溫冷凍切片機(jī)顯微圖象處理系統(tǒng)PCR儀PCR儀謝謝！

待測RNA樣品

↓←單鏈DNA探針（M13體系合成）

液相雜交

↓

DNA-RNA雜交雙鏈

↓←核酸酶S1（專一降解未雜交的DNA和RNA單鏈）