甘草黃酮和甘草酸的提取及含量測(cè)定

甘草黃酮和甘草酸的提取及含量測(cè)定

甘草是多年生草本植物。它通常生長在中國西北、華北和東北地區(qū)干旱地區(qū)的溫帶沙漠和溫帶牧場(chǎng)上。隨著帶寬的延伸，它呈東西走向南北的條狀分布。中心分布在新疆塔里木河流區(qū)和內(nèi)蒙古西歐多斯高原。甘草是一種應(yīng)用極廣的中藥材,素有“十方九草”之稱,現(xiàn)代藥理研究證明甘草具有抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)、抗?jié)?、抗HIV、誘生干擾素、調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫功能、抗癌等作用;甘草的化學(xué)成份據(jù)報(bào)道有100多種黃酮類化合物、60多種三萜類化合物以及香豆素類、氨基酸、雌性激素、有機(jī)酸等,但其主要有效成分是黃酮和甘草酸。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,超聲技術(shù)已廣泛應(yīng)用于中草藥有效成分的提取,而溶劑則是影響提取效果的主要因素之一。本研究采用超聲技術(shù)對(duì)甘草中黃酮和甘草酸進(jìn)行聯(lián)合提取,篩選影響提取效果的最佳溶劑系統(tǒng),為提高甘草的有效利用率奠定產(chǎn)業(yè)基礎(chǔ)。1機(jī)器、藥品和材料1.1外可見分光光度計(jì)、設(shè)高速離心、電子天平技術(shù)KQ-250R型超聲波提取器(昆山市超聲儀器有限公司);紫外可見分光光度計(jì)(上海棱光技術(shù)有限公司);低速離心機(jī)(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠);電子天平(北京塞多利斯天平儀器廠);精密pH計(jì)(上海雷磁儀器廠);粉碎裝置(溫嶺市大眾電器廠)。1.2甘草酸單銨鹽s柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品鑒定所);甘草酸單銨鹽標(biāo)準(zhǔn)品(浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所);乙醇(95%);甲醇;氫氧化鈉(S);氫氧化鉀(S);氫氧化鈣(S)。1.3材料表面甘草(新疆烏拉爾甘草,人工載培二年生品種,石河子天德制藥廠提供)2實(shí)驗(yàn)方法2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備2.1.1柚子皮苷的吸收值測(cè)定精密稱取適量柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇溶解,定容于10mL容量瓶中,制得濃度約為1.0mg?mL-1的對(duì)照品溶液。準(zhǔn)確吸取柚皮苷對(duì)照品溶液0.10mL,加入5.00mL甲醇及2.50mL10%KOH溶液,室溫放置5min,用甲醇定容至50mL,試樣空白為參比液,于200~600nm波長處掃描,結(jié)果在417nm處有最大吸收。精密吸取柚皮苷對(duì)照品溶液0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6mL,分別加入5mL甲醇,再加入10%KOH溶液2.5mL,室溫放置5min,用甲醇稀釋至50mL,在417nm處測(cè)定其吸收值。測(cè)定結(jié)果計(jì)算得線性回歸方程:y=40.548x-0.008(r=0.9999)2.1.2最大吸收波長分析精密稱取適量甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品用50%的乙醇溶液配成0.4218mg?mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。試劑空白為參比液,于200~600nm波長處掃描,結(jié)果在259nm處有最大吸收。分別精密量取0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,用50%的乙醇溶液稀釋至25mL,在最大吸收波長λmax=259nm處測(cè)其吸光度,測(cè)定結(jié)果計(jì)算得線性回歸方程:y=29.352x+0.10656(r=0.9984)2.2甘草黃酮和甘草酸的聯(lián)合提取和測(cè)定為了考察不同溶劑對(duì)甘草黃酮和甘草酸提取效果的影響,在以下的實(shí)驗(yàn)中,所使用的甘草均為人工栽培兩年生的烏拉爾甘草,且實(shí)驗(yàn)條件完全相同。2.2.1提取甘草黃酮和甘草酸準(zhǔn)確稱取40目的甘草粉末4份,質(zhì)量均為1.50g,分別用石灰乳液、堿水溶液、混合堿液、BWE混合溶劑[注]四種不同的溶劑聯(lián)合提取甘草黃酮和甘草酸。在室溫下,超聲提取兩次,每次15min,將兩次濾液合并作為樣品液。2.2.2bwd的提取準(zhǔn)確吸取樣品液0.50mL,加入2.50mL甲醇,再加入1.25mL10%的氫氧化鉀溶液,室溫放置5min,用甲醇定容至25.00mL,試樣空白為參比液,用紫外可見分光光度計(jì),在最大吸收波長λmax=417nm處測(cè)甘草黃酮的吸光度(結(jié)果見表1)。準(zhǔn)確吸取樣品液0.20mL,分別用50%的乙醇溶液定容至50.00mL,試劑空白為參比液,用紫外可見分光光度計(jì),在最大吸收波長λmax=259nm處測(cè)甘草酸的吸光度(結(jié)果見表1)。的混合溶劑。由表1可以得出,BWE混合溶劑提取甘草黃酮和甘草酸含量最高。對(duì)結(jié)果用SPSS軟件進(jìn)行方差分析(LSD)結(jié)果見表2。由表2可知BWE混合溶劑均與石灰乳液、堿水溶液、混合堿液間存在極顯著差異。2.3最佳溶劑濃度的選擇鑒于BWE混合溶劑的提取效果最佳,因此,對(duì)BWE混合溶劑在不同濃度時(shí)的提取效果作進(jìn)一步的研究。2.3.1bwi混合溶劑提取甘草黃酮和甘草酸的活性用電子天平準(zhǔn)確稱取40目的甘草粉末5份,質(zhì)量均為1.50g,分別用20%、40%、60%、80%、95%的BWE混合溶劑聯(lián)合提取,在室溫下,超聲提取兩次,每次15min,將兩次濾液合并作為樣品液。準(zhǔn)確吸取樣品液0.20mL,加入1.00mL甲醇,再加入0.50mL10%的氫氧化鉀溶液,室溫放置5min,用甲醇定容至25.00mL,試樣空白為參比液,用紫外可見分光光度計(jì),在最大吸收波長λmax=417nm處測(cè)甘草黃酮的吸光度(結(jié)果見表3)。準(zhǔn)確吸取樣品液0.20mL,分別用50%的乙醇溶液定容至50.00mL,試劑空白為參比液,用紫外可見分光光度計(jì),在最大吸收波長λmax=259nm處測(cè)甘草酸的吸光度(表3)。由表3可看出BWE混合溶劑在40%-80%濃度范圍內(nèi),對(duì)甘草黃酮和甘草酸的提取效果均較好。為確定該溶劑的最佳濃度,需進(jìn)一步研究在該濃度范圍內(nèi),BWE混合溶劑的濃度與提取效果的關(guān)系。2.3.2不同bwi混合溶劑對(duì)甘草黃酮和甘草酸含量的影響在BWE混合溶劑濃度為40%-80%范圍內(nèi),以10%為一個(gè)濃度梯度,提取甘草黃酮和甘草酸,重復(fù)2.3.1的實(shí)驗(yàn),最終確定提取溶劑的最佳濃度。結(jié)果見表4。由表4可以看出,70%BWE混合溶劑提取甘草黃酮和甘草酸含量最高。對(duì)結(jié)果用SPSS軟件進(jìn)行方差分析(LSD)結(jié)果見表5。由表5可知70%BWE混合溶劑均與40%、50%、60%、80%的BWE混合溶劑間存在極顯著差異。因此,確定70%BWE混合溶劑為最佳提取溶劑。3提取溶劑的選擇(1)甘草中總黃酮含量大多以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品,用分光光度法測(cè)定。但據(jù)報(bào)道,甘草中黃酮成分以查爾酮類和二氫黃酮類化合物為主,為此我們利用二氫黃酮在10%KOH溶液的條件下可轉(zhuǎn)化為查爾酮,最大吸收波長轉(zhuǎn)移至400nm以上的特性,在可見光區(qū)以柚皮苷為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定甘草中總黃酮的含量。本方法中柚皮苷溶液的最大吸收波長與樣品溶液的最大吸收波長很接近,測(cè)定結(jié)果表明本法重現(xiàn)性好,簡(jiǎn)單可行。(2)根據(jù)甘草黃酮和甘草酸的結(jié)構(gòu)和性質(zhì),分析文獻(xiàn)中甘草黃酮和甘草酸的提取方法,總結(jié)得出兩者都可用堿性水液或BWE混合溶劑提取,故本論文選用石灰乳液、堿水溶液、混合堿液、BWE混合溶劑為提取溶劑。(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在相同的條件下,四種不同溶劑系統(tǒng)對(duì)甘草黃酮和甘草酸的聯(lián)合提取效果,以BWE混合溶