獸用聚肌胞注射液鑒別研究

獸用聚肌胞注射液鑒別研究

雙瘤：雙醇：c，這是由雙醇和雙烯酸在一定條件下混合的。這是一種高效的抗病毒性藥物（ifn）抗生素，具有廣闊的光譜抗病毒、腫瘤、部分細(xì)菌和原生動(dòng)物感染、刺激和吞咽、身體免疫等多種保護(hù)作用。PolyI:C注射液目前已廣泛應(yīng)用于人醫(yī)臨床診療中,顯示了良好的抗病毒、抗腫瘤效果。而PolyI:C注射液在動(dòng)物病毒性疾病防治中盡管也有顯示其良好抗病毒效果的報(bào)道,但PolyI:C至今尚未獲得國(guó)家農(nóng)業(yè)部允許其在動(dòng)物病毒性疾病治療上應(yīng)用的正式許可。鑒于目前獸醫(yī)臨床上抗病毒類藥物嚴(yán)重匱乏的現(xiàn)實(shí),為了實(shí)現(xiàn)PolyI:C將來(lái)在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用和推廣,有必要展開(kāi)PolyI:C在動(dòng)物機(jī)體使用效能的系統(tǒng)研究,其中制訂獸用PolyI:C制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是其研究的必要內(nèi)容之一。本文的主要目的在于建立獸用聚肌胞注射液的檢測(cè)方法和質(zhì)量檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。1材料和方法1.1儀器和標(biāo)準(zhǔn)品獸用PolyI:C注射液由瑞普(天津)生物藥業(yè)有限公司研發(fā)中心提供,批號(hào)為08080601,含量為1mg/mL,標(biāo)準(zhǔn)品tRNA為Sigma公司產(chǎn)品,批號(hào)R8759,含量99%;紫外分光光度儀(TU-1900雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì))為北京普析通用儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品;圓盤(pán)電泳槽(DYCZ-27B型)為北京市六一儀器廠產(chǎn)品。1.2polii：c的識(shí)別1.2.1菲啶溴紅的紫外觀察取獸用PolyI:C注射液1mL,加入菲啶溴紅溶液(取0.02mg菲啶溴紅加入100mL水即得)0.5mL,置紫外燈(254nm)下觀察。1.2.2紫外分光光度法取獸用PolyI:C注射液1mL,加入氯化鈉-磷酸鹽緩沖液(pH7.2),制成每毫升中約含有0.04mg的溶液,按照中華人民共和國(guó)獸藥典2005年版一部介紹的紫外分光光度法進(jìn)行測(cè)定。1.3polii：c的定量檢測(cè)1.3.1樣品的消化與測(cè)定對(duì)照品溶液的制備:精密稱取105℃干燥至恒重的磷酸二氫鉀2.195g,置500mL容量瓶中,加水使溶解并稀釋至刻度,搖勻,再精密量取5mL,置500mL容量瓶中,加水至刻度,搖勻即得每1mL中含磷10μg的溶液。PolyI:C注射液消化處理:精密量取獸用PolyI:C注射液1mL,置凱氏燒瓶中,加5mol/L硫酸溶液3.0mL,于140～160℃消化2～4h。待溶液呈黃褐色后,放置冷卻,加30%過(guò)氧化氫1～2滴,繼續(xù)消化,直至溶液透明。放置冷卻后,加水0.5mL,水浴加熱10min,放置冷卻,轉(zhuǎn)移至50mL量瓶中,加水至刻度。線性試驗(yàn):精密量取獸用PolyI:C的消化稀釋液0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.5mL,分別加水2.6,2.4,2.2,2.0,1.8,1.5mL,然后加入定磷試劑(6mol/L鹽酸-水-2.5%鉬酸銨-10%抗壞血酸1:2:1:1)3mL,搖勻,45℃加熱25min,立即冷至室溫。按照分光光度法,在660nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度。溶液穩(wěn)定性:取獸用PolyI:C注射液消化后顯色,冷至室溫,并在室溫下(25℃)放置,分別于0,1,2,3,4h,在660nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度?；厥章试囼?yàn):精密稱取聚肌苷酸和聚胞苷酸各50mg,加水溶解后轉(zhuǎn)移至100mL量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻得供試品溶液。精密量取供試品溶液0.8,1,1.2mL,每樣3份,共9份,經(jīng)消化處理。放冷后,加水0.5mL,水浴加熱10min,放冷,轉(zhuǎn)移至50mL量瓶中,加水至刻度。然后按樣品測(cè)定項(xiàng)所述進(jìn)行含量測(cè)定,計(jì)算回收率。樣品測(cè)定:精密量取獸用PolyI:C消化稀釋液1mL,加水2mL,定磷試劑3mL,搖勻,45℃加熱25min,立即冷至室溫,660nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度。精密量取獸用PolyI:C注射液2mL,置離心管中,加沉淀劑(鉬酸銨1g,加70%過(guò)氯酸14mL,水386mL)2.0mL,搖勻,4000r/min離心15min,精密量取此溶液1mL,置25mL量瓶中,加水至刻度,搖勻。精密量取此溶液1mL,同上法自“分別加水2mL”起,依法測(cè)定。精密量取對(duì)照品溶液0.8mL,分別加水2.2mL,定磷試劑3mL,搖勻,45℃加熱25min,立即冷至室溫。在660nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度。同法測(cè)定6份PolyI:C樣品。PolyI:C(%)=(總磷量-無(wú)機(jī)磷量)×10.25/m×100%。其中10.25為核酸與磷的折算系數(shù);m為取樣量。1.3.2trna檢測(cè)限的確定參照文獻(xiàn)的方法進(jìn)行。標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備:取已知沉降系數(shù)為4S的核糖核酸(tRNA),加水制成每1mL含1mg的溶液。取1mL,加入溴酚藍(lán)指示液1滴和蔗糖0.4g,使溶解,備用。供試品溶液的制備:取獸用PolyI:C注射液1mL,加入溴酚藍(lán)指示液1滴和蔗糖0.4g,使溶解,備用。檢測(cè)限試驗(yàn):精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品核糖核酸(tR-NA),加水制成每1mL含10mg的溶液,分別精密量取0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL置10mL容量瓶,加水稀釋至刻度;取1mL,加入溴酚藍(lán)指示液1滴和蔗糖0.4g。再分別取上述溶液各100μL(含tRNA分別為10,20,40,60,80,100μg),分別加入6支凝膠柱中,進(jìn)行電泳。操作法:供試品、標(biāo)準(zhǔn)品兩種溶液的上樣量均為100μL,調(diào)整電流至每管約5mA,4～10℃下電泳約1.5～2h(待溴酚藍(lán)色環(huán)達(dá)到距底端2cm處即可)。取膠后進(jìn)行染色和脫色,將膠條置燈下觀察,根據(jù)供試品、標(biāo)準(zhǔn)品的色帶位置和色澤深淺程度進(jìn)行判斷。同樣方法分別在6支圓盤(pán)電泳槽的凝膠柱中進(jìn)行電泳。按下式計(jì)算相對(duì)遷移率:相對(duì)遷移率(Rf)=加樣端到供試品或標(biāo)準(zhǔn)品區(qū)帶的距離/加樣端到溴酚藍(lán)區(qū)帶的距離2結(jié)果2.1熒光增強(qiáng)的nm將加入菲錠溴紅的獸用PolyI:C注射液,置紫外燈(254nm)下觀察,可見(jiàn)熒光明顯增強(qiáng);特征光譜掃描結(jié)果顯示,獸用PolyI:C注射液在266nm波長(zhǎng)處有最大吸收,在231nm波長(zhǎng)處有最小吸收(圖1),吸光度分別為0.542和0.407。2.2實(shí)際檢測(cè)結(jié)果以吸收度為縱坐標(biāo),取樣量為橫坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,測(cè)得線性相關(guān)系數(shù)為0.9999,表明在0.4～1.5mL的取樣量范圍內(nèi),獸用PolyI:C消化液取樣量與吸光度的線性關(guān)系良好(表1)。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算,獸用PolyI:C注射液含量為97.8%(6批PolyI:C注射液含量分別為97.8%,96.5%,100.2%,97.4%,93.4%,98.7%,所得結(jié)果的RSD為2.3%,重復(fù)性良好)。顯色反應(yīng)后的對(duì)照品溶液及獸用polyI:C溶液在室溫(25℃)條件下放置4h內(nèi)穩(wěn)定(表1)?；厥章试囼?yàn)結(jié)果顯示聚肌胞注射液的加樣回收率良好(表2),平均回收率為100.81%,RSD為2.02%。獸用PolyI:C注射液沉降系數(shù)檢查結(jié)果顯示,其遷移率小于標(biāo)準(zhǔn)品的遷移率(表3),說(shuō)明其沉降系數(shù)大于4S。檢測(cè)方法重復(fù)性良好(RSD=2.27%)。而且檢測(cè)限試驗(yàn)結(jié)果顯示,當(dāng)點(diǎn)樣量為20μg時(shí),即能較清楚地檢視。3測(cè)定polyi:c含量的方法PolyI:C為雙鏈核酸,與溴乙錠(EB)結(jié)合后可產(chǎn)生較強(qiáng)熒光,而單鏈、三鏈PolyI:C則無(wú)此現(xiàn)象。試驗(yàn)結(jié)果顯示,PolyI:C在200～300nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)有紫外吸收,在266nm波長(zhǎng)處有最大吸收,231nm波長(zhǎng)處有最小吸收。據(jù)此可以對(duì)PolyI:C注射液進(jìn)行定性鑒別。曾有用熒光法測(cè)定聚肌胞含量的報(bào)道,此法專屬性較強(qiáng)。但所用試劑EB是強(qiáng)誘變劑,可以嵌入堿基分子中導(dǎo)致錯(cuò)配,容易引起有機(jī)體突變,具有高致癌性。從而限制了該法的使用。由于PolyI:C為含磷有機(jī)化合物,分子中含兩個(gè)磷,每1mg的磷相當(dāng)于10.25mg的PolyI:C,因此,通常應(yīng)用定磷法來(lái)測(cè)定PolyI:C的含量。在酸性環(huán)境中,定磷試劑中的鉬酸銨以鉬酸形式與樣品中的磷酸反應(yīng)生成磷鉬酸,當(dāng)有還原劑存在時(shí)磷鉬酸立即轉(zhuǎn)變成藍(lán)色的還原產(chǎn)物鉬藍(lán),鉬藍(lán)在660nm波長(zhǎng)處有最大吸收。而且由于在一定濃度范圍內(nèi),顏色的深淺與磷含量成正比關(guān)系,因此可應(yīng)用分光光度法進(jìn)行磷的定量測(cè)定。但在具體檢測(cè)時(shí),測(cè)定供試品中PolyI:C的總磷量需用硫酸或過(guò)氯酸消化成無(wú)機(jī)磷后方可再行測(cè)定,根據(jù)供試品中總磷量減去無(wú)機(jī)磷量,即得PolyI:C的含磷量,并由此計(jì)算出PolyI:C的含量。我們的試驗(yàn)結(jié)果顯示,PolyI:C注射液的平均含量為97.8%,其重復(fù)性良好(RSD為2.3%),平均回收率為100.81(RSD為=2.02%)。我們?cè)谠囼?yàn)中也發(fā)現(xiàn),利用定磷法測(cè)定核酸時(shí),盡管樣品先經(jīng)過(guò)消化后能消除一些物質(zhì)的干擾,而且定磷試劑與磷生成深藍(lán)色的鉬藍(lán),專屬性強(qiáng),靈敏度高,可廣泛應(yīng)用于各種復(fù)方制劑中核酸含量的測(cè)定,不過(guò),定磷法易因消化操作的條件而產(chǎn)生誤差,操作中要格外注意。沉降系數(shù)與粒子的大小有關(guān)。在一定條件下,生物高分子的相對(duì)分子質(zhì)量大者,其沉降速度(沉降系數(shù))較大。當(dāng)對(duì)某些生物高分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)或相對(duì)分子質(zhì)量不明確時(shí),可用沉降系數(shù)對(duì)其特性進(jìn)行初步描述,以示區(qū)別,如4SRNA、10SRNA、23SRNA中4SRNA的粒子最小。PAGE電泳也能反映相對(duì)分子質(zhì)量的不同。相對(duì)分子質(zhì)量小者,粒子的直徑較小,在電場(chǎng)中泳動(dòng)速度就快,反之則慢。不同粒子在同一