野生歐李實生群體葉片過氧化物酶同工酶譜分析

野生歐李實生群體葉片過氧化物酶同工酶譜分析

奧羅斯瓜西亞斯（b）是中國特有的野生果樹資源，具有良好的抗逆性。這種水果不僅含有豐富的糖、蛋白質(zhì)和氨基酸，還含有鈣、鐵等養(yǎng)分，因此吸引了人們的注意。野生歐李種質(zhì)資源種群變異存在相對一致性、多樣性與復(fù)雜性,這是野生歐李在長期演變進化過程中自然雜交多變、劣變的結(jié)果,使其在花色、果實形狀、果實顏色、果實風味、果實成熟期、葉片形狀以及不同樹相等方面存在著豐富的遺傳變異類型,這為野生歐李特異品質(zhì)的篩選和種質(zhì)創(chuàng)新提供了可能,具有重要的研究意義和價值。過氧化物酶(POD)同工酶在高等植物中廣泛而大量地存在,具有高度多型性、器官組織特異性和相對穩(wěn)定性,即同一器官的同一發(fā)育時期,POD同工酶酶譜和活性強弱是穩(wěn)定的,能夠反映植物生長發(fā)育的特點、體內(nèi)代謝狀況及其對外界環(huán)境的適應(yīng)性。運用同工酶分析技術(shù)可以揭示群間或居群內(nèi)甚至居群下不同個體間或親緣種之間的遺傳變異規(guī)律,從而揭示同一個種內(nèi)不同居群和同一個居群不同個體在遺傳上的多樣性。生物體的遺傳性狀(包括形態(tài)特征、生理生化特性)都是由基因控制的,等位基因不同,它們所控制的相對遺傳性狀就不同,然而,僅通過酶譜的直觀描述,還無法分析不同類型的遺傳差異。有關(guān)研究者報道,不同材料中處于相同位置的酶帶其酶量大小存在明顯的差異,說明性質(zhì)相同的酶帶在遺傳上并不一定完全一致。鑒于野生歐李具有豐富的遺傳性狀表現(xiàn),而有關(guān)運用同工酶分析技術(shù)探討酶譜上酶的表達和量上的差異的系統(tǒng)研究卻尚未開展,為此,通過分析同一生境條件下野生歐李群體果實成熟期葉片過氧化物酶同工酶酶譜特性及酶量(酶帶寬窄)差異變化情況與葉片和果實生理形狀的變化數(shù)量,進一步揭示歐李過氧化物酶同工酶與葉片和果實生理性狀的相關(guān)規(guī)律,以期為歐李同工酶技術(shù)在數(shù)量性狀遺傳變異上的應(yīng)用提供理論參考。1材料和方法1.1分生長、生長結(jié)果性狀試驗用的歐李來源于燕山山脈野生歐李群體,實生繁殖并定植于河北科技師范學(xué)院園藝園林試驗站野生歐李資源圃內(nèi)。圃內(nèi)樹體叢生,株高70~80cm,樹齡為10a。3月上旬芽體開始萌動,始花期為4月中旬,終花期為4月末,花色為白色;果實成熟期為7月下旬至8月上旬,果實質(zhì)量大小不等,單果質(zhì)量1~10g,果實形狀為扁圓形或圓形或桃形,果實顏色呈粉紅色或鮮紅色或紫紅色;葉片形狀呈披針形或卵圓形,葉片顏色呈淺綠色或綠色?？傊?其遺傳形態(tài)特征和生理性狀呈現(xiàn)出多樣性。1.2果實和葉片抗氧化指標的測定與分析試驗采用隨機區(qū)組設(shè)計,單株小區(qū),在歐李果實成熟期(7月下旬至8月上旬)選擇遺傳特征(包括果實顏色、果實形狀、果實大小、葉片顏色、葉片大小、葉片形狀、株型大小、不同成熟期等形態(tài)特征)存在明顯差異的不同單株個體113株,在每株結(jié)果基生枝中上部隨機采集果實樣品60個,同時在相應(yīng)單株結(jié)果基生枝中上部采集健康無病的成熟葉片80片,分別裝入塑料袋并封好,即刻帶回實驗室,用去離子水將果實和葉片樣品清洗干凈后,再用濾紙吸干水分,隨機選取部分果實和葉片樣品(葉片30片、果實30個),測定其單葉鮮質(zhì)量、單葉干質(zhì)量、葉片含水百分率、單葉長度、單葉寬度、單葉長寬比、單果鮮質(zhì)量、單果鮮果果肉質(zhì)量、單果干果果肉質(zhì)量、單果核質(zhì)量、單果含水百分率及單果橫縱徑等生理性狀指標值,并計算其平均值。將剩余部分果實和葉片樣品保存在超低溫(-76℃)的冰箱中,待樣品收集完整后再進行過氧化物酶同工酶等指標的測定與分析。采用垂直平板不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳方法測定過氧化物酶同工酶,樣品提取、分離、點樣、染色等參照文獻中的測定方法進行操作,將染色的膠板取出后用水漂洗、照相、繪制圖譜,然后于7%的冰醋酸中固定保存,每個樣品重復(fù)電泳2次。利用GelDocXR凝膠成像分析系統(tǒng)(美國伯樂)對凝膠圖像進行分析,并計算每個樣品所對應(yīng)的酶帶酶量的相對值。根據(jù)每張POD同工酶膠版上的譜帶的分布及遷移率繪制模式圖處理數(shù)據(jù)。遺傳距離的分析方法為:采用“0-1”方法記錄酶帶位置,有帶為1,無帶為0。采用DPS數(shù)據(jù)分析軟件進行系統(tǒng)聚類分析。2結(jié)果與分析2.1歐李單株材料的酶譜類型及酶譜行為同一生境條件下果實成熟期歐李群體葉片過氧化物酶(POD)同工酶的酶譜類型共有7種(詳見表1):類型Ⅰ,出現(xiàn)頻率最高,占總數(shù)的54.87%,是歐李果實成熟期葉片的基本酶譜類型;類型Ⅱ,出現(xiàn)頻率次之,占總數(shù)的24.78%;類型Ⅲ,出現(xiàn)頻率占總數(shù)的10.62%;類型Ⅳ,占總數(shù)的4.42%;類型Ⅴ占總數(shù)的2.65%;類型Ⅵ,占總數(shù)的1.77%,出現(xiàn)頻率較低,也是其特殊類型;類型Ⅶ,為歐李特有類型,出現(xiàn)頻率極低,僅占總數(shù)的0.89%。歐李果實成熟期葉片過氧化物酶(POD)同工酶共分離出5條酶帶,其中的Rf0.126和Rf0.716這2條酶帶為113個歐李單株個體所共有。根據(jù)113份野生歐李單株個體試材的電泳譜圖,利用DPS結(jié)果數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對其進行系統(tǒng)聚類分析,得到樹形聚類圖(如圖1)。從圖1中可以看出,當遺傳距離Rf為1.04時,113個參試歐李單株個體可分為2個基本類型和3個特殊類型。第1個基本類型,包括2種酶譜類型。其由具有Rf0.126和Rf0.716酶帶的第Ⅰ種酶譜類型和具有Rf0.126、Rf0.716和Rf0.753酶帶的第Ⅲ種酶譜類型組成,表明這兩種類型的單株個體間的遺傳距離較為接近,其特點是有兩條相同的酶帶Rf0.126和Rf0.716出現(xiàn)。第2個基本類型,包括2種酶譜類型。其由具有Rf0.126、Rf0.235和Rf0.716酶帶的第Ⅱ種酶譜類型和具有Rf0.126、Rf0.235、Rf0.716和Rf0.753酶帶的第Ⅴ種酶譜類型組成,表明這兩種類型單株個體具有較近的遺傳距離,其特點是有三條相同的酶帶Rf0.126、Rf0.235和Rf0.716出現(xiàn)。92.92%的參試歐李單株個體材料都屬于上述2個基本類型。此外,還有其他3個特殊類型(7.08%),包括具有Rf0.017、Rf0.126和Rf0.716酶帶的第Ⅳ種酶譜類型和具備Rf0.017、Rf0.126、Rf0.235和Rf0.716酶帶的第Ⅵ種酶譜類型與具有Rf0.017、Rf0.126、Rf0.235和Rf0.716、Rf0.753酶帶的第Ⅶ種酶譜類型。通過凝膠成像系統(tǒng)對歐李不同單株個體材料譜帶相對酶量的大小進行了量化分析,結(jié)果如表2。表2顯示,酶量大小的變化因酶譜遷移距離、酶譜類型、歐李單株個體等因素的不同而變化,其變化特點有如下兩點。一是相同酶譜類型不同單株個體其酶帶相對酶量大小和變異系數(shù)存在著明顯的差異。二是不同酶譜類型各酶帶相對酶量大小和變異系數(shù)的差異較大:第Ⅰ、Ⅲ酶譜類型,以Rf0.716酶帶相對酶量的均值為最大,以Rf0.126酶帶酶量的變異系數(shù)為最大;第Ⅱ、Ⅴ酶譜類型,以Rf0.716酶帶相對酶量的均值為最大,以Rf0.235酶帶酶量的變異系數(shù)為最大;第Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ酶譜類型,以Rf0.716酶帶相對酶量的均值為最大,以Rf0.017酶帶酶量的變異系數(shù)為最大。由此可見,歐李不同單株個體酶譜類型的分布情況與酶量大小的變化規(guī)律相吻合,這表明,同一生境條件下相同時期野生歐李不同單株個體間酶量大小的變化在一定程度上反映了其遺傳差異和親緣關(guān)系。2.2不同酶譜類型對歐李群體主要生理性狀的影響歐李不同酶譜類型葉片(單葉)其生理性狀的差異情況如表3。由表3可知,歐李群體果實發(fā)育期其葉片的顏色、形狀、大小(質(zhì)量、長度和寬度)及含水率等生理性狀指標值因單株個體不同而存在明顯的差異,變異系數(shù)變化較大,變異系數(shù)最高達40.46%(酶譜類型Ⅲ葉片的干質(zhì)量),變異系數(shù)大小總體表現(xiàn)為葉片干鮮質(zhì)量>葉片的長與寬>葉片含水百分率,且其在POD同工酶不同酶譜類型中表現(xiàn)各異;歐李群體葉片顏色總體呈綠色或淺綠色,葉片形狀呈披針形或卵圓形,而在不同酶譜類型中,葉片顏色均以綠色葉片所占比例較大,葉片形狀均以披針形葉片所占比例較大(酶譜類型Ⅱ的卵圓形比例較大)。由此可以看出,同一生境條件下歐李群體葉片性狀因單株個體不同而表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性。歐李不同酶譜類型果實(單果)其生理性狀的差異情況如表4。由表4可知,歐李群體果實成熟期其果實的顏色、形狀、粘離核、果肉干鮮質(zhì)量、果核質(zhì)量、果肉含水百分率及縱橫徑等生理性狀指標值因單株個體的不同而表現(xiàn)出明顯的差異,其變異系數(shù)較大,變異系數(shù)最高達90.91%(酶譜類型Ⅵ的果肉干質(zhì)量),其果實變異系數(shù)的大小總體表現(xiàn)為單果干鮮質(zhì)量>縱橫徑>果肉含水百分率,且在POD同工酶不同酶譜類型中表現(xiàn)各異;與相對應(yīng)的單株葉片性狀變異程度比較,果實干鮮質(zhì)量變異系數(shù)明顯大于葉片干鮮質(zhì)量的變異系數(shù),果實橫縱徑的變異系數(shù)與葉片長寬的變異系數(shù)基本持平,而葉片中含水百分率的變異系數(shù)明顯高于果肉含水百分率的變異系數(shù);歐李群體果實顏色由粉紅色(淺)至紫紅色(深)而變化,且鮮紅色果實所占比例較大,果實形狀有扁圓形、圓形和桃形,其中扁圓形果實所占比例較大,果核包括粘核和離核兩種類型,其中粘核果實所占比例較高,不同酶譜類型的表現(xiàn)規(guī)律較為一致。由此可以看出,同一生境條件下歐李群體果實性狀的變化規(guī)律與其對應(yīng)的單株個體葉片性狀的變化規(guī)律一致,均因單株個體不同而表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性。2.3歐李群體單株酶譜相對酶量與果實生理性狀指標的相關(guān)性對歐李群體單株個體過氧化物酶同工酶酶譜相對酶量的大小變化與葉片生理性狀指標的相關(guān)性進行了分析,結(jié)果如表5。表5顯示,酶譜相對酶量的大小與葉片生理性狀指標存在一定的相關(guān)性,不同酶譜類型歐李群體的相關(guān)程度各異,其中酶譜類型Ⅰ中Rf0.126譜帶和Rf0.716譜帶的酶量大小與葉片寬度分別呈極顯著正相關(guān)和極顯著負相關(guān),與葉片長寬比分別呈顯著負相關(guān)和顯著正相關(guān);酶譜類型Ⅱ中Rf0.235譜帶和Rf0.716譜帶酶量的大小與葉片含水百分率分別呈顯著正相關(guān)和顯著負相關(guān);酶譜類型Ⅲ中Rf0.716譜帶酶量的大小與葉片含水百分率呈極顯著負相關(guān);酶譜類型Ⅳ和Ⅴ中譜帶酶量的大小與葉片各生理性狀指標的相關(guān)性均未達到顯著水平,但個別譜帶酶量的大小與葉片相關(guān)指標呈現(xiàn)高度相關(guān)關(guān)系(如酶譜類型Ⅳ中的Rf0.017,酶譜類型Ⅴ中的Rf0.235、Rf0.716和Rf0.753)。由此可以看出,同一生境條件下歐李群體過氧化物酶同工酶酶譜相對酶量的大小變化在一定程度上反映了葉片組織器官的生理性狀的遺傳變化規(guī)律。對歐李群體單株個體過氧化物酶同工酶酶譜相對酶量大小與果實生理性狀指標的相關(guān)性進行了分析,結(jié)果如表6。表6顯示,將不同酶譜類型歐李群體單株個體酶譜相對酶量大小與果實生理性狀指標的相關(guān)性和葉片性狀的相關(guān)性進行比較,結(jié)果表明,其相關(guān)程度及范圍略差。除了酶譜類型Ⅳ中的Rf0.017譜帶酶量大小與果實鮮質(zhì)量、果肉干質(zhì)量和果實縱經(jīng)大小呈顯著或極顯著負相關(guān),酶譜類型Ⅴ中的Rf0.126譜帶酶量大小與果實縱經(jīng)大小呈極顯著負相關(guān)之外,其他酶譜類型中的不同譜帶酶量大小與果實生理指標的相關(guān)性均未達到顯著水平。由此可見,同一生境條件下的歐李群體過氧化物酶同工酶酶譜相對酶量大小變化在一定程度上也反映出成熟期果實的生理形狀變化,其相關(guān)程度較低可能與成熟期果實本身生理性狀變異程度較大(變異系數(shù)大小)有關(guān)。3歐李實生群體的酶譜分析同一生境條件下果實成熟期歐李實生群體葉片過氧化物酶(POD)同工酶酶譜共分離出5條酶帶,其中Rf0.126和Rf0.716這2條酶帶為113個歐李單株個體所共有,這是歐李群體單株個體材料共有的特征帶,其酶譜類型較為豐富。其中,由Rf0.126和Rf0.716酶帶組成的酶譜類型出現(xiàn)的頻率最高,占參試材料總數(shù)的54.87%,可以認為,這是歐李實生群體的基本酶譜類型;由酶帶Rf0.017、Rf0.126、Rf0.235、Rf0.716和Rf0.753組成的酶譜類型是其特有類型,只占參試材料總數(shù)的0.89%。根據(jù)113株歐李單株個體酶譜類型系統(tǒng)聚類分析結(jié)果,113個參試的歐李單株個體可以分為2個基本類型和3個特殊類型群體。對113株歐李實生群體單株個體材料酶帶相對酶量的大小進行了數(shù)量化分析,結(jié)果顯示,相同酶譜類型群體材料不同單株個體酶帶相對酶量大小存在明顯的差異,并且不同酶譜類型酶量的大小及變異程度所表現(xiàn)出的規(guī)律與系統(tǒng)聚類分析結(jié)果非常吻合。由此推斷,同一生境條件下歐李實生群體過氧化物酶同工酶酶譜相對酶量大小變化在一定程度上反映出其存在著遺傳差異和親緣關(guān)系。有關(guān)研究者認為,酶譜只是一種表現(xiàn)型,酶譜上酶的表達與否及量的多少是受其基因和基因型決定的,只通過酶譜的直觀描述,就無法得知量的差異,缺少量的分析資料,也就無法確定差異的程度與大小,這樣就掩蓋了相同酶帶在不同材料中酶活性和酶量上的明顯差異,而這種差異往往是由遺傳差異而引起的。文中研究結(jié)果顯示,不同酶譜類型中位置相同的酶帶在不同單株個體中表現(xiàn)出酶量上存在明顯的差異,這就充分說明,性質(zhì)相同的酶帶在遺傳上并不一定完全一致。將同工酶譜數(shù)量化,并且對參試材料的其他生理性狀指標進行相關(guān)分析,能使分析結(jié)果較為精確地反映不同材料間的遺傳差異。相關(guān)分