宮腔內(nèi)人工授精精子分離指標(biāo)的變化及精子形態(tài)對(duì)其分離效果的影響

宮腔內(nèi)人工授精精子分離指標(biāo)的變化及精子形態(tài)對(duì)其分離效果的影響

宮內(nèi)個(gè)性化（iui）是一種簡(jiǎn)單有效的輔助新生兒技術(shù)，適用于宮頸因素、男性因素、子宮內(nèi)膜缺損和免疫因素引起的不孕癥。一般來(lái)說(shuō),進(jìn)行IUI前通常要洗滌精子,以選出活力較好的精子,有利于提高IUI的成功率。密度梯度離心法是其中一種常用的精子優(yōu)選法,本文就優(yōu)選前后的精子活力、形態(tài)及回收率等作前瞻性研究,分析密度梯度離心法對(duì)精子分離的效果。1數(shù)據(jù)和方法1.1精的質(zhì)量證和轉(zhuǎn)陰選擇2008年9-10月間在深圳市婦幼保健院生殖健康科進(jìn)行宮腔內(nèi)夫精人工授精的所有精液51份。所有患者均符合以下條件:(1)排除艾滋病、梅毒、丙肝、淋病、尖銳濕疣等傳染性疾病;(2)術(shù)前檢查發(fā)現(xiàn)支原體或衣原體陽(yáng)性者,須經(jīng)規(guī)則治療轉(zhuǎn)陰;(3)男性因素患者經(jīng)外周血染色體核型檢查證實(shí)為正常。1.2方法1.2.1精子含量測(cè)定術(shù)前男方禁欲3~7d,手淫法采集精液于廣口無(wú)菌無(wú)毒容器中,置室溫充分液化30min,記錄精液量、液化時(shí)間、精子計(jì)數(shù)、存活率、活動(dòng)精子總數(shù)。1.2.2spermgrad小鼠精子密度的測(cè)定依照試劑操作指南,以SpermRinse將SpermGrad(瑞典Vitrolife公司)稀釋配成90%、45%SpermGrad,用巴士德吸管吸取90%SpermGrad2.0mL置于一支新的離心管底部,再吸取45%SpermGrad2.0mL小心加于90%SpermGrad上,保證兩者之間的界面清晰,放置37℃、6%CO2培養(yǎng)箱平衡。將液化后充分混勻的精液2.0mL加于預(yù)先平衡好的90%、45%SpermGrad上層,保持界面清晰,1500r/min離心20min,移去上層的精漿和分離液,將錐形管底層的精子團(tuán)混勻,移至平衡好的SpermRinse2.0mL中,混勻后500r/min離心10min,棄上清,將錐形管底層的精子團(tuán)混勻,移至平衡好的IVF-602.0mL中,混勻后500r/min離心10min,棄上清,視底層精子的多少留取0.2~0.5mL培養(yǎng)液,將精子混勻,記錄處理后精子密度、存活率、活動(dòng)精子總數(shù)。精子計(jì)數(shù)及活力分級(jí)參照WHO實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)。1.2.3精子畸形試驗(yàn)依照WHO實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn),精子液化后及優(yōu)選后分別涂片,自然風(fēng)干后采用DiffQuik快速染色法染色,在光學(xué)顯微鏡油鏡(×1000)下,每片讀取200個(gè)精子,用Krüger′s嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)法進(jìn)行判別,計(jì)數(shù)正常形態(tài)及畸形精子,對(duì)畸形精子根據(jù)畸形部位分為頭部畸形、頸部畸形、尾部畸形。1.3精子形態(tài)的比較采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析,各種精子形態(tài)之間的比較采用Wilcoxon配對(duì)符號(hào)秩和檢驗(yàn),結(jié)果以中位數(shù)表示;均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn),結(jié)果以表示;相關(guān)性使用簡(jiǎn)單相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。x±s2結(jié)果2.1密度梯度離心法回收精子見(jiàn)表1,結(jié)果顯示分離后精子存活率顯著提高(P<0.05),表明密度梯度離心法可以有效地回收活力好的精子。精子回收率均值為4.15%~78.40%(25.84±16.57)%。2.2不同畸形精子比例的變化見(jiàn)表2。結(jié)果顯示:采用密度梯度離心法分離精子后,正常形態(tài)的精子比例顯著提高,各種畸形精子的比例均顯著降低,尤其是頸部和尾部畸形精子的降低最為明顯。2.3精子分離前后密度、活率、活動(dòng)精子總數(shù)的檢測(cè)結(jié)果根據(jù)處理前精子正常形態(tài)的比例分為≤4%、5%~14%、≥15%3組,各組離心前后精子指標(biāo)及回收率的比較見(jiàn)表3。結(jié)果顯示各組精子分離前密度、活率、活動(dòng)精子總數(shù)及分離后密度、活動(dòng)精子總數(shù)均差異無(wú)顯著性(P>0.05),只有分離后精子活率和回收率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對(duì)精子正常形態(tài)比例與精子回收率作相關(guān)性分析,呈正相關(guān)(r=0.456,P=0.001),隨正常形態(tài)精子的比例升高,回收率增加。3充分利用多種方法回收精子在體內(nèi)環(huán)境中,活力好、具受精能力的精子通過(guò)主動(dòng)穿越宮頸黏液與女性陰道內(nèi)的無(wú)活力精子、雜質(zhì)及精漿分離。在此過(guò)程中,不僅選擇出快速前向運(yùn)動(dòng)的精子,而且男性生殖細(xì)胞還經(jīng)歷了生理學(xué)改變,也就是“獲能”,這是精子發(fā)生頂體反應(yīng)的基本先決條件。而當(dāng)我們實(shí)施宮腔內(nèi)人工授精時(shí),通過(guò)導(dǎo)管直接將精子送入宮腔內(nèi),跨過(guò)了宮頸這一關(guān),雖然進(jìn)入宮腔的精子數(shù)目增多了,但同時(shí)也失去了宮頸的屏障和選擇作用,因此IUI之前對(duì)精子進(jìn)行洗滌是必需的。經(jīng)過(guò)洗滌可去除精漿中的ROS、前列腺素、抗精子抗體及其他微生物,并啟動(dòng)精子獲能,獲得優(yōu)選濃縮高活力且具受精能力的精子懸液。常用的精子優(yōu)選法有游動(dòng)法、密度梯度離心法和過(guò)濾法幾類,每一類里又有多種方法可選擇,目前較常用的是上游法、上游-沉淀法、玻璃纖維過(guò)濾法、密度梯度離心法等,每種方法各有利弊。上游法和上游-沉淀法簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì),但是依賴于精子自身的運(yùn)動(dòng)能力,因此回收率較低,不適用于活力較差和密度較低的精液。玻璃纖維過(guò)濾法利用精子前向運(yùn)動(dòng)能力和玻璃纖維的過(guò)濾作用回收精子,成功的關(guān)鍵在于所用玻璃纖維的品種,回收率較高,也可應(yīng)用于少弱畸精癥,但是費(fèi)用較高且仍有雜質(zhì)殘留,國(guó)內(nèi)應(yīng)用較少。密度梯度離心法利用活力好的精子在離心時(shí)比活力差或無(wú)活力的細(xì)胞更主動(dòng)地沿沉淀梯度的方向運(yùn)動(dòng)、從而迅速穿過(guò)不同密度界面的特點(diǎn),可以回收較多的活力好的精子,與上游法相比,回收率較高,亦適用于少弱精癥,但是較為費(fèi)時(shí)而且費(fèi)用較高;相比玻璃纖維過(guò)濾法則具有清除雜質(zhì)較為徹底的優(yōu)點(diǎn)。目前市場(chǎng)上商品化的密度梯度介質(zhì)均是硅烷包裹的二氧化硅微粒,毒性低、無(wú)刺激性,已被批準(zhǔn)用于人體。Ding等及Rosselli等證實(shí)離心后一氧化氮水平顯著降低,后者對(duì)精子具有毒性,可降低精子活力。已有多個(gè)研究證實(shí)這些產(chǎn)品用于分離精子可獲得與Percoll相似或更好的效果,本研究使用Spermgrad分離精子,數(shù)據(jù)顯示:精子活率由處理前的平均55.63%顯著提高到處理后的平均88.75%,平均回收率達(dá)25.84%,而且正常形態(tài)中位數(shù)由9%提高到18%,說(shuō)明Spermgrad分離精子可以獲得滿意的效果。本研究比較了離心前后精子形態(tài)學(xué)的變化,發(fā)現(xiàn)畸形精子以頭部畸形為主,這與宋影等的研究結(jié)果相似,經(jīng)密度梯度離心后,頭部、頸部和尾部畸形精子的比例均有顯著下降,特別是頸部和尾部畸形精子比例下降尤為明顯,幾乎可以完全去除。本研究未對(duì)頭部畸形作進(jìn)一步分類,無(wú)法判斷不同種類的頭部畸形經(jīng)離心后去除的程度是否不同。本研究還根據(jù)精子正常形態(tài)比例分組比較,發(fā)現(xiàn):(1)雖然正常形態(tài)比例不同,各組間分離前精子密度、活率及活動(dòng)精子總數(shù)并無(wú)差別;(2)分離后精子密度和活動(dòng)精子總數(shù)雖然無(wú)組間差異,但是≤4%與≥15%兩組比較差異有顯著性,分離后的精子存活率也有顯著性差異;(3)精子形態(tài)與回收率呈正相關(guān)。上述統(tǒng)計(jì)結(jié)果提示:(1)畸形率高的精子經(jīng)回收處理后死精比例也較高,產(chǎn)生較多的ROS等因子,會(huì)影響其他精子的功能,從而影