家兔精液常溫保存方法的研究

家兔精液常溫保存方法的研究

隨著兔子人工精細(xì)技術(shù)在一體化養(yǎng)兔子場的普及和應(yīng)用，精細(xì)保護(hù)技術(shù)越來越受到重視，并正在發(fā)揮輔助作用。雖然冷凍精液不受地域和時間的限制,家兔的精液冷凍保存研究早于其他家畜,但進(jìn)展緩慢,在生產(chǎn)實踐中沒有得到廣泛的應(yīng)用。從液態(tài)精液保存效果來看,常溫保存更有利于兔的實際生產(chǎn)應(yīng)用中。為此,近年來精液常溫保存方法已廣泛應(yīng)用于兔的人工授精技術(shù)中。目前,市場上主要從國外引入的稀釋液和常用的0.9%生理鹽水、5%葡萄糖和葡-檸-卵,國外進(jìn)口稀釋液價格較貴,對規(guī)?；脠鲳B(yǎng)殖,0.9%生理鹽水、5%葡萄糖效果不佳,而葡-檸-卵稀釋液要先用現(xiàn)配,使用不方便,針對以上情況。研究開發(fā)國內(nèi)優(yōu)良稀釋液,對增加養(yǎng)兔效益,推動兔規(guī)?；B(yǎng)殖和人工授精技術(shù)的應(yīng)用具有重要意義。本試驗為研制優(yōu)良稀釋液而進(jìn)行有益的探索。1材料和方法1.1試驗時間和地點2009年4月20日～2009年11月22日。山東省德州肉兔場。1.2進(jìn)口稀釋粉葡萄糖(分析純)、Tris、檸檬酸、檸檬酸鈉(分析純)、氯化鉀、碳酸氫鈉、EDTA(分析純)、青霉素、鏈霉素、德國進(jìn)口稀釋粉。試驗儀器:密度儀,電子顯微鏡,恒溫水浴鍋,雙蒸餾水器,磁力攪拌器,恒溫板,精密溫度計。1.3樣品采集供試驗用精液隨機(jī)采自肉兔場健康公兔,采用采精器采集5只公兔精液混合后備用,鏡檢活率在0.8以上者供稀釋保存使用。1.4溶液稀釋0.9%生理鹽水、5%葡萄糖、葡-檸-卵稀釋配方、自配葡-檸-EDTA、Tris-葡-檸配方和德國進(jìn)口稀釋液(見表1)。1.5參考稀釋溶液的保藏效應(yīng)觀察1.5.1雙蒸水溶液的配制按配方要求準(zhǔn)確稱量稀釋液各成分,并放入消毒過的干燥燒杯內(nèi),用雙蒸水稀釋至100mL,用玻璃棒攪拌使其充分溶解。溶解后每100mL稀釋液加入青霉素、鏈霉素各10萬IU(μg),稀釋液現(xiàn)配現(xiàn)用。1.5.2稀釋和轉(zhuǎn)存精子活力在0.8以上,密度在7×108以上。對所采的精液分別用5種稀釋液按1∶6～1∶10倍等溫稀釋,稀釋精液時,將稀釋液沿杯壁慢慢倒入精液中,然后將分裝好的精液轉(zhuǎn)存于15℃恒溫箱內(nèi)保存。1.5.3計算生存時間,計算活力無定時分布按10級評分法評定精子的活力,每6h觀察評定1次,直至精子全部死亡,根據(jù)活力變化情況,計算有效存活時間(精子活力在0.5以上的保存時間)、總存活時間(精子全部失活的保存時間)、生存指數(shù)(∑[﹙上次活力+下次活力﹚/﹙2×?xí)r間間隔﹚]。1.6混合試驗經(jīng)產(chǎn)母兔采用孕馬血清激素和超排3號同期誘導(dǎo)發(fā)情,稀釋液稀釋精液1～2d的保存后,對發(fā)情母兔進(jìn)行輸精,采用摸胎方式確定受胎率。1.7處理數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)分析用SPSS13.0統(tǒng)計軟件中的t檢驗及方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。2試驗結(jié)果與分析2.1葡-檸-卵、葡萄糖、小鼠精子總現(xiàn)存時間見表2。從表2可以得知,保存于Tris-葡-檸、葡-檸-EDTA和德國進(jìn)口稀釋粉的精子的有效存活時間差異不顯著(P>0.05),較葡-檸-卵分別延長29.2h、35.6h、32.6h,差異極顯著(P<0.01),較5%葡萄糖和0.9%生理鹽水延長48.8h、55.2h、52.2h和50.3h、56.7h、53.7h,差異極顯著(P<0.01)。而精子總存活時間與精子有效存活時間有相似趨勢。結(jié)果表明,從精子總存活時間與精子有效存活時間來看,Tris-葡-檸、葡-檸-EDTA和德國進(jìn)口稀釋液保存效果最好。2.2不同進(jìn)口稀釋液保存精子的生存指數(shù)由表3可知,Tris-葡-檸、葡-檸-EDTA和德國進(jìn)口稀釋液保存精子的生存指數(shù)差異不顯著(P>0.05),都極顯著高于其他3種常用稀釋液(P<0.01)。2.3稀釋液的受胎率不同稀釋液保存精液輸精后受胎率統(tǒng)計結(jié)果見表4。精子的保存時間過長,會導(dǎo)致精子畸形率上升,受胎率下降,葡-檸-EDTA、Tris-葡-檸和德國進(jìn)口稀釋液稀釋液保存1d和2d內(nèi),受胎率都是最高的,而0.9%生理鹽水和5%葡萄糖保存是受胎率最低。在兔場規(guī)?；B(yǎng)殖過程中,保存于稀釋液中1～2d的精液足以滿足人工授精的需求。3稀釋液的配制對精子有效存活時間、總存活時間、生存指數(shù)和受胎率的測定結(jié)果表明,葡-檸-EDTA、Tris-葡-檸和德國進(jìn)口稀釋液保存效果一致,保存精子的效果優(yōu)于0.9%生理鹽水、5%葡萄糖和葡-檸-卵。從價格成本上計算,德國進(jìn)口稀釋液>Tris-葡-檸>葡