大孔吸附樹脂法分離純化表沒食子兒茶素沒食子酸酯的研究

大孔吸附樹脂法分離純化表沒食子兒茶素沒食子酸酯的研究

（-）-表所需兒茶素的非物質(zhì)酸酯（ecgg）是提取茶葉的多羥基酚類化合物，黃烷醇是其中的一種?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明[1~3],EGCG具有顯著的抗氧化活性,是維生素C的100多倍,維生素E的25倍,能夠保護(hù)細(xì)胞和DNA受損害,具有抑制和抵抗病毒和細(xì)菌、抑制和預(yù)防心血管疾病、預(yù)防和抗癌、預(yù)防和治療輻射傷害、延緩衰老等功效?？蓮V泛的應(yīng)用于藥品、食品、保健食品、化妝品等領(lǐng)域,具有廣闊的應(yīng)用前景及開發(fā)價(jià)值。茶葉中茶多酚中除了含有EGCG外,還存在(-)-表沒食子兒茶素(ECG),(-)-表兒茶素沒食子酸酯(EGC)等結(jié)構(gòu)和性質(zhì)十分相近的化合物。因此,分離得到高純度的EGCG一直是研究的熱點(diǎn)[4~5]。圖1是茶多酚中主要酚類化合物的結(jié)構(gòu)式,圖2是我們從茶葉中分離出來的粗茶多酚提取物的HPLC圖。圖2中分別標(biāo)示出EGCG和咖啡因(CAFF)的峰,其中EGCG含量為15%,咖啡因含量為6.1%。文獻(xiàn)報(bào)道EGCG的分離方法有許多,但大多存在分離步驟復(fù)雜,分離成本高,不適合工業(yè)化生產(chǎn)等缺點(diǎn)[6~8]。本文擬采用大孔吸附樹脂分離方法,試圖找到一條適合工業(yè)化的生產(chǎn)方式,下面報(bào)道試驗(yàn)結(jié)果。1材料和方法1.1樣品和試劑茶多酚粗提取物(EGCG含量15%),自制;乙醇,分析純;甲醇,色譜純;乙腈,色譜純;EGCG標(biāo)樣,購于美國Sigma公司;大孔吸附樹脂D3520、D4006、D4020、X-5、AB-8、NKA-9、S-8購于南開大學(xué)化工廠;DM130由山東魯抗立科藥物化學(xué)有限公司提供。HL-2恒流泵上海青浦滬西儀器廠;HP1200液相色譜AgilentTechnologiesCo.,USA。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1淋洗乙醇,凈化乙醇將8種大孔樹脂分別用無水乙醇浸泡24h,充分溶脹,用無水乙醇淋洗至流出液加水不呈白色混濁,水洗凈乙醇;2倍體積的5%HCl淋洗并浸泡4h,水洗至中性;2倍體積的2%NaOH溶液淋洗并浸泡4h,水洗至中性。1.2.2醋酸溶液及乙腈溶液采用HPCL法測定,色譜條件:300SB-C18色譜柱,柱溫30℃。流動相由2%(v/v)醋酸水溶液(A)和乙腈(B)組成,洗脫梯度(A:B)為0min,100:0;6min,96:4;25min,85:15;40min,75:25;60min,0:100。流速1.0mL/min,檢測波長:280nm,進(jìn)樣量25μL。1.2.3茶多酚提取液的制備精確稱取經(jīng)預(yù)處理的樹脂各2.0g于50mL具塞磨口三角瓶中,加入10mL茶多酚提取液(20mg/mL),每隔5min振搖10s,持續(xù)2h,然后靜置24h,使其達(dá)到飽和吸附,吸取上層液,測定EGCG的含量。按下式計(jì)算樹脂靜態(tài)飽和吸附量和吸附率:1.2.4洗脫溶液中ecgg濃度的測定取充分吸附后的樹脂,水洗去除樹脂表面殘留的溶液,準(zhǔn)確加入70%乙醇20mL,振搖24h,過濾,測定洗脫液中EGCG的質(zhì)量濃度。計(jì)算洗脫率如下:1.2.5溫度對茶多酚提取劑吸附行為的影響取150g預(yù)處理過的樹脂裝柱(3.5cmi.d.×60cm),吸取500mLEGCG含量為1.5%的茶多酚提取液上柱,用20%的乙醇作洗脫劑,流速7mL/min,進(jìn)行溫度(25、30﹑40、50、60℃)對樹脂吸附性能的影響試驗(yàn),考察溫度對樹脂分離效能的影響。1.2.6洗脫溶劑和液液制備取150g預(yù)處理過的樹脂裝柱(3.5cmi.d.×60cm),吸取500mLEGCG含量為1.5%的茶多酚提取液在最高允許溫度下上柱進(jìn)行洗脫,流速7mL/min,預(yù)先用水洗至流出液在280nm下無吸收,然后依次用5%、10%、20%﹑40%、60%﹑95%的乙醇進(jìn)行梯度洗脫,每250mL收集一次洗脫液,收集EGCG組分。2結(jié)果與討論2.1樹脂篩選2.1.1和吸附率本文測定了8種大孔樹脂對EGCG靜態(tài)吸附量和吸附率(表1)。從幾種大孔樹脂對EGCG的吸附量大小可以初步確定X-5、AB-8和DM130是可選擇用于EGCG分離純化的樹脂。2.1.2b-8樹脂對ecgg的解析本文測定了8種大孔樹脂對EGCG的靜態(tài)解析率(表1)。從結(jié)果可知AB-8樹脂對EGCG的解析效果最好,其次是DM130。綜合吸附和解析結(jié)果,AB-8大孔吸附樹脂對EGCG的靜態(tài)飽和吸附量和解析率都較高,因此選擇AB-8大孔吸附樹脂為從茶多酚中分離純化EGCG的樹脂。2.2洗脫溫度的確定一般來講,洗脫劑洗脫濃度越低(即乙醇含量越低)樹脂分離效果就越好,但會導(dǎo)致洗脫周期過長,洗脫體積過大,不利于工業(yè)化生產(chǎn)。因此,有必要研究洗脫時(shí)最高允許的溫度。我們用20%乙醇作洗脫劑時(shí),考察在EGCG回收率在90%時(shí),不同洗脫溫度對洗脫液體積和EGCG含量的影響,結(jié)果見表2。從表2可以看出,在保持相同回收率的前提下,溫度越高,洗脫劑體積越小,分離得到的EGCG含量也越高。但當(dāng)溫度達(dá)到60℃時(shí),分離效果又降低,這主要是由于溫度太高,乙醇會產(chǎn)生氣化現(xiàn)象,影響了分離效果。因此,50℃是洗脫操作最高允許溫度。2.3洗脫溶劑濃度對ecgg純度的影響目前工業(yè)化生產(chǎn)含量50%~60%的EGCG產(chǎn)品,采用的是濃度40%左右的乙醇洗脫液。該濃度洗脫劑由于乙醇含量高,分離效果較差,要得到更高純度的EGCG,應(yīng)采用低于40%乙醇的洗脫劑。但同時(shí)會引起洗脫體積太大的缺點(diǎn),為此,我們在50℃洗脫溫度下,在保持相同回收率條件下,研究不同洗脫劑濃度對EGCG純度的影響,結(jié)果見表3。從表3可以看出,當(dāng)洗脫劑濃度在10%時(shí),在50℃條件下洗脫,EGCG的含量可達(dá)到92.6%(見圖3),洗脫劑體積和回收率均達(dá)理想狀況,同時(shí)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),這樣處理獲得的EGCG產(chǎn)品,咖啡因含量低于0.5%。3ecgg的分離純化高純度的EGCG(含量90%以上)的生物活性及其生產(chǎn)方法目前已成為研究的熱點(diǎn),其應(yīng)用前景十分廣闊。本文采用大孔吸附樹脂法分