蛋白質(zhì)的分離純化和鑒定

3-11蛋白質(zhì)的別離、純化和鑒定1整理課件2整理課件一、細(xì)胞破碎動(dòng)物細(xì)胞：電動(dòng)搗碎機(jī)、勻漿器、超聲波破碎法植物組織：勻漿器、石英砂研磨微生物：溶菌酶+超聲波3整理課件二、抽提選擇適宜的溶劑防止目的蛋白質(zhì)的變性在低溫下進(jìn)行4整理課件三、別離鹽析法：常用硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉、硫酸鎂等。特點(diǎn)為平安、簡便、分辨率不高有機(jī)溶劑沉淀法：常用丙酮和乙醇。特點(diǎn)為分辨率稍高，高濃度溶劑易引起變性等電點(diǎn)沉淀法：蛋白質(zhì)能保持天然構(gòu)象和活性、沉淀不完全吸附法：常用硅膠、活性炭、氧化鋁等。適用于處理大量樣品超濾法5整理課件四、純化1、離子交換層析2、凝膠過濾原理：根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的不同進(jìn)行別離介質(zhì)特點(diǎn)：內(nèi)部多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)常用的凝膠：葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠優(yōu)點(diǎn)：別離條件溫和，不影響樣品的生物活性；樣品損失小，回收率高。6整理課件7整理課件習(xí)題指出以下蛋白質(zhì)通過凝膠過濾層析柱〔蛋白質(zhì)別離范圍從5000到400000〕時(shí)的洗脫順序。肌紅蛋白：16900；過氧化氫酶：247500；細(xì)胞色素C：13370；肌球蛋白：524800；胰凝乳蛋白酶原：23240；血清清蛋白：68500。8整理課件3、疏水作用層析原理：利用蛋白質(zhì)外表的非極性基團(tuán)和介質(zhì)上的疏水基團(tuán)間的疏水作用來別離蛋白質(zhì)的層析方法。介質(zhì)：以瓊脂糖為母體，偶聯(lián)上非極性基團(tuán)。如苯基瓊脂糖、辛基瓊脂糖等。洗脫：高離子強(qiáng)度增加疏水作用。高濃度硫酸銨存在下將蛋白質(zhì)吸附在介質(zhì)上，然后逐漸降低硫酸銨的濃度進(jìn)行洗脫。9整理課件4、親和層析原理：根據(jù)蛋白質(zhì)能與特異的配體相結(jié)合而設(shè)計(jì)的方法。如抗體與抗原、激素與受體、酶與底物、酶與抑制劑等。10整理課件五、鑒定1、純度鑒定：電泳法、HPLC法2、相對分子質(zhì)量的測定：超離心法、凝膠過濾法、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法3、等電點(diǎn)的測定4、生物活性的測定11整理課件巰基乙醇：破壞-S-S-電泳過程蛋白質(zhì)電泳遷移率取決于相對分子質(zhì)量，與其所帶電荷和分子形狀無關(guān)

LogMr=a–bμμ=樣品遷移距離/前沿遷移距離SDS：變性劑破壞分子中的-H和疏水作用。改變蛋白質(zhì)的帶電狀態(tài)、改變蛋白質(zhì)單體分子構(gòu)象。12整理課件13整理課件六、蛋白質(zhì)含量的測定總蛋白含量分析：凱氏定氮法、Folin-酚法〔Lowry法〕、雙縮脲法、考馬斯亮藍(lán)法、紫外吸收法特定蛋白組分的含量分析：酶、激素等測定活性14整理課件三聚氰胺結(jié)構(gòu)用途：廣泛應(yīng)用于木材、塑料、涂料、造紙、紡織、皮革、電氣、醫(yī)藥等行業(yè)根據(jù)美國食物及藥物管理局的標(biāo)準(zhǔn)，三聚氰胺可容忍攝入量為每日0.63毫克/公斤體重假蛋白原理：蛋白質(zhì)主要由氨基酸組成，其含氮量一般不超過30%，而三聚氰胺的分子中含氮量為66％左右。通用的蛋白質(zhì)測試方法“凱氏定氮法〞是通過測出含氮量來估算蛋白質(zhì)含量，因此，添加三聚氰胺會使得食品的蛋白質(zhì)測試含量偏高，從而使劣質(zhì)食品通過