transwell原理和技術(shù)模板

./Transwell實驗原理與操作步驟Trans-這個詞根有轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)運、穿過等意思,well有小室的意思,可以從字面上理解,這是一類有通透性的杯狀的裝置,根據(jù)Corning公司的Transwell說明書中的介紹,可以認為這是一種膜濾器〔Membrane

filters,也可認為是一種有通透性的支架〔permeable

supports。更準確地說,Transwell應該是一種實驗技術(shù),這項技術(shù)的主要材料是Transwell小室〔Transwell

chamber,Transwell

insert,其外形為一個可放置在孔板里的小杯子,不同廠家對Transwell會有不同的命名,而不同型號也可有不同形狀,不同大小,根據(jù)實驗需要,可有不同選擇。但無論是何種外形,其關(guān)鍵部分都是一致的,那就是杯子底層的一有通透性的膜,而杯子其余部分的材料與普通的孔板是一樣。這層膜帶有微孔,孔徑大小有0.1－12.0μm,根據(jù)不同需要可用不同材料,一般常用的是聚碳酸酯膜〔polycarbonate

membrane。

將Transwell小室放入培養(yǎng)板中,小室稱上室,培養(yǎng)板稱下室,上室盛裝上層培養(yǎng)液,下室盛裝下層培養(yǎng)液,上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔。我們將細胞種在上室,由于聚碳酸酯膜有通透性,下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室的細胞,從而可以研究下層培養(yǎng)液中的成分對細胞生長、運動等的影響。應用不同孔徑和經(jīng)過不同處理的聚碳酸酯膜,就可以進行共培養(yǎng)、細胞趨化、細胞遷移、細胞侵襲等多種方面的研究。當然不同細胞其體積不同,具體選擇時要考慮到細胞大小。這里主要談幾種大家常用的實驗：

〔1共培養(yǎng)體系：

小于3.0um孔徑條件下,細胞不會遷徙通過,因此,若研究不涉及細胞運動能力,不需要細胞穿過聚碳酸酯膜,則應選擇3.0μm以下孔徑。常用0.4、3.0μm。我們實驗室用的是0.4μm。將細胞A種于上室,細胞B種于下室,可以研究細胞B分泌或代產(chǎn)生的物質(zhì)對細胞A的影響?！?趨化性實驗：可用5.0、8.0、12.0μm膜,上室細胞可穿過聚碳酸酯膜進入下室,計數(shù)進入下室的細胞量可反映下室成分對上室細胞的趨化能力。①細胞B對細胞A的趨化作用：將細胞A種于上室,細胞B種于下室,可以研究細胞B分泌或代產(chǎn)生的物質(zhì)對細胞A的趨化作用。②趨化因子對細胞的趨化作用：將細胞種于上室,下室加入某種趨化因子,可研究該趨化因子對細胞的趨化作用?！?腫瘤細胞遷移實驗：常用8.0、12.0μm膜,上室種腫瘤細胞,下室加入FBS或某些特定的趨化因子,腫瘤細胞會向營養(yǎng)成分高的下室跑,計數(shù)進入下室的細胞量可反映腫瘤細胞的遷移能力。〔4腫瘤細胞侵襲實驗常用8.0、12.0μm膜,原理與腫瘤細胞遷移實驗類似。

transwell侵襲實驗,其實原理簡單地說就是用一層膜將高營養(yǎng)的培養(yǎng)液和低營養(yǎng)的培養(yǎng)液隔開,細胞放在低營養(yǎng)的培養(yǎng)液里,為了找吃的,細胞會往高營養(yǎng)的培養(yǎng)液里面跑,但是有膜擋著,所以要穿過膜才行。我們在膜上涂上一層基質(zhì)膠,模仿細胞外基質(zhì),于是細胞要把基質(zhì)消化了才可以從低營養(yǎng)的培養(yǎng)液跑到高營養(yǎng)的培養(yǎng)液里面,最后我們檢測高營養(yǎng)的培養(yǎng)液里細胞量就可以知道細胞的侵襲能力了,大概原理就是這樣的。第一節(jié)概念這里想明確兩個概念,一個是Transwell,另一個是腫瘤細胞侵襲模型。

1.Transwell

關(guān)于Transwell這個詞該如何解釋,查了很多資料也未見準確的注解,我覺得可以這么理解吧,trans-這個詞根有轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)運、穿過等意思,well有小室的意思,可以從字面上理解,這是一類有通透性的杯狀的裝置,根據(jù)Corning公司的Transwell說明書中的介紹,可以認為這是一種膜濾器〔Membrane

filters,也可認為是一種有通透性的支架〔permeable

supports。準確地說,Transwell應該是一種實驗技術(shù),這項技術(shù)的主要材料是Transwell小室〔Transwell

chamber,Transwell

insert,其外形為一個可放置在孔板里的小杯子,不同廠家對Transwell會有不同的命名,而不同型號也可有不同形狀,不同大小,根據(jù)實驗需要,可有不同選擇.但無論是何種外形,其關(guān)鍵部分都是一致的,那就是杯子底層的一有通透性的膜,而杯子其余部分的材料與普通的孔板是一樣。這層膜帶有微孔,孔徑大小有0.1－12.0μm,根據(jù)不同需要可用不同材料,一般常用的是聚碳酸酯膜〔polycarbonate

membrane.將Transwell小室放入培養(yǎng)板中,小室稱上室,培養(yǎng)板稱下室,上室盛裝上層培養(yǎng)液,下室盛裝下層培養(yǎng)液,上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔。我們將細胞種在上室,由于聚碳酸酯膜有通透性,下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室的細胞,從而可以研究下層培養(yǎng)液中的成分對細胞生長、運動等的影響。應用不同孔徑和經(jīng)過不同處理的聚碳酸酯膜,就可以進行共培養(yǎng)、細胞趨化、細胞遷移、細胞侵襲等多種方面的研究。下面參考guxuefeng戰(zhàn)友和cosmosci戰(zhàn)友的帖子具體來談談孔徑的選擇,當然不同細胞其體積不同,具體選擇時要考慮到細胞大小。這里主要談幾種大家常用的實驗：〔1共培養(yǎng)體系：小于3.0um孔徑條件下,細胞不會遷徙通過,因此,若研究不涉及細胞運動能力,不需要細胞穿過聚碳酸酯膜,則應選擇3.0μm以下孔徑。常用0.4、3.0μm。我們實驗室用的是0.4μm。將細胞A種于上室,細胞B種于下室,可以研究細胞B分泌或代產(chǎn)生的物質(zhì)對細胞A的影響?！?趨化性實驗可用5.0、8.0、12.0μm膜,上室細胞可穿過聚碳酸酯膜進入下室,計數(shù)進入下室的細胞量可反映下室成分對上室細胞的趨化能力。胞B對細胞A的趨化作用：將細胞A種于上室,細胞B種于下室,可以研究細胞B分泌或代產(chǎn)生的物質(zhì)對細胞A的趨化作用。趨化因子對細胞的趨化作用：將細胞種于上室,下室加入某種趨化因子,可研究該趨化因子對細胞的趨化作用?！?腫瘤細胞遷移實驗常用8.0、12.0μm膜,上室種腫瘤細胞,下室加入FBS或某些特定的趨化因子,腫瘤細胞會向營養(yǎng)成分高的下室跑,計數(shù)進入下室的細胞量可反映腫瘤細胞的遷移能力?！?腫瘤細胞侵襲實驗常用8.0、12.0μm膜,原理與腫瘤細胞遷移實驗類似。

上室種腫瘤細胞,下室加入FBS或某些特定的趨化因子,腫瘤細胞會向營養(yǎng)成分高的下室跑,但與腫瘤細胞遷移實驗不同的是,聚碳酸酯膜上室側(cè)鋪上一層基質(zhì)膠,用以模仿體細胞外基質(zhì),細胞欲進入下室,先要分泌基質(zhì)金屬蛋白酶〔MMPs將基質(zhì)膠降解,方可通過聚碳酸酯膜。計數(shù)進入下室的細胞量可反映腫瘤細胞的侵襲能力。

2.腫瘤細胞侵襲模型

用于研究腫瘤細胞侵襲能力的腫瘤細胞侵襲模型有如下幾種〔引自司徒鎮(zhèn)強《細胞培養(yǎng)》：

2.1

體癌細胞侵襲模型

2.1.1

皮下移植侵襲模型

2.1.2

肌肉移植侵襲模型

2.1.3

腹腔移植侵襲模型

2.1.4

小鼠腎包膜下移植侵襲模型

2.1.5

鼠睪丸包膜下移植侵襲模型

2.1.6

小鼠耳廓皮下移植侵襲模型

2.1.7

鼠爪墊皮下移植侵襲模型

2.1.8

視網(wǎng)界膜侵襲模型

2.2

體外癌細胞侵襲模型

2.2.1

體外靜止器官培養(yǎng)法

2.2.1.1

半固體培養(yǎng)基單細胞器官培養(yǎng)法

2.2.1.2

液體培養(yǎng)基單細胞器官培養(yǎng)法

2.2.2

半體外半體器官培養(yǎng)法。2.2.3

單層細胞器官培養(yǎng)法

2.2.4

瘤細胞球體器官培養(yǎng)法

2.2.4.1

靜止球體器官培養(yǎng)法

2.2.4.2

旋轉(zhuǎn)搖動球體器官培養(yǎng)法

2.2.5

單層細胞侵襲實驗模型

2.2.6

Transwell侵襲小室測定法

可見,Transwell與侵襲實驗之間并不能劃等號,Transwell有多種應用,侵襲實驗也有多種方法。所謂Transwell侵襲實驗,其實是指將Transwell這一技術(shù)應用于腫瘤細胞侵襲研究的一種實驗。由于其簡單易行、重復性好,因而得到了越來越廣泛的應用,但不能認為研究腫瘤侵襲只有Transwell一種方法。

第二節(jié)

Transwell侵襲實驗

我的課題涉及Transwell侵襲實驗和Transwell遷移實驗,其他方面的Transwell應用我不太清楚,因此這里主要談談Transwell侵襲實驗。

1.實驗用品：

①

Transwell小室：

多種廠家可提供,論壇里常用的是Costar、Corning、BD生產(chǎn)的小室,我們實驗室用的是Chemicon公司的ECM550系列,另有Boyden

chamber、Millipore公司的millicell和雕弓滿月射天狼戰(zhàn)友介紹的Thincert。

這些廠家提供的小室,有的已鋪好基質(zhì)膠,買來就可以用,很方便,但也比較貴,我們實驗室用的Chemicon公司的ECM550系列是已經(jīng)鋪好膠的,質(zhì)量很好,但是非常貴,24孔板配套的小室,每個價格約130元,不推薦給大家。BD也有已包被好的,價格不清楚。Coster和Corning公司生產(chǎn)的小室,是論壇里比較常用的,好像是要自己鋪膠,但據(jù)說每個小室成本只有40左右,應該比較適合中國國情。

下面是一些戰(zhàn)友提供的價格,具體建議大家聯(lián)系代理商咨詢。linanping1979戰(zhàn)友提供的價格：coster的24孔板的transwell的價格是456元RMB,8μm,用于腫瘤的侵襲實驗。iceyxy戰(zhàn)友提供的價格：Millipore的8μm的50個1760RMB,0.4μm的2000多,是一次性的。梅林戰(zhàn)友提供的BD價格：

240RMB一塊〔6.5um,24孔,12instert,好像是沒膠的。liguofan說國產(chǎn)的boyden30塊一個。jjyy提供的價格是：corning

cat

No.3422.下層常用含5%－10%

FBS的培養(yǎng)基,具體濃度根據(jù)細胞侵襲力而定,侵襲力弱的細胞可適當提高FBS濃度。下層也可用趨化因子,有戰(zhàn)友將纖維粘連蛋白加入下層培養(yǎng)液作為趨化因子,但個人認為,FBS仍是最合適的。

⑥

細胞培養(yǎng)板：

常用于Transwell侵襲實驗的細胞培養(yǎng)板有6孔板、12孔板、24孔板等,以24孔最常用。細胞培養(yǎng)板沒什么特殊要求,普通的細胞培養(yǎng)板就可以。但要注意,細胞培養(yǎng)板應當與購買的Transwell小室相配套。

⑦

此外,膜的下室面可涂上纖維粘連蛋白<fibronectin,FN,Sigma有售>,這樣做的目的是使穿過膜的細胞更好地附著在膜上,也可用膠原〔collagen或明膠〔gelatin。很多戰(zhàn)友認為這不是必須的,而且我也是不涂的,細胞照樣貼壁很好。如果貼壁不好的話可以試試看。linanping1979戰(zhàn)友認為,如果培養(yǎng)時間很長〔>24h,細胞還是會掉到下室里面去,所以有條件的話,最好還是在膜下層涂上FN。

另外,值得一提的是,膜下層涂上FN還有一定的趨化作用。

2．步驟

2.1

Transwell小室制備

2.1.1

無基質(zhì)膠Transwell小室制備

①

包被基底膜：

用50mg/LMatrigel

1:8稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面,4℃風干。如果需要在下室面鋪FN的話,可將200ul槍頭的尖端剪掉,吸取FN均勻涂抹在小室的下面。用膠原〔collagen的話,一般配成0.5mg/ml,直接用槍吸了涂在膜上。

②

水化基底膜：

吸出培養(yǎng)板中殘余液體,每孔加入50ul含10g/LBSA的無血清培養(yǎng)液,37℃,30min。

另有tianjin_glioma戰(zhàn)友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀釋后的Matrigel

<3.9ug/ul>

60-80μl

<注意體積不可太大,以剛把聚碳酸酯膜浸濕為最好>,置37℃

30min使Matrigel聚合成凝膠。

2.1.2

有基質(zhì)膠的Transwell小室制備

Chemicon公司的ECM550系列說明書要求,將小室放入培養(yǎng)板中,在上室加入300μl預溫的無血清培養(yǎng)基,室溫下靜置15－30min,使基質(zhì)膠再水化。再吸去剩余培養(yǎng)液。

2.2

制備細胞懸液

①

制備細胞懸液前可先讓細胞撤血清饑餓12－24h,進一步去除血清的影響。但這一步并不是必須的。

②

消化細胞,終止消化后離心棄去培養(yǎng)液,用PBS洗1－2遍,用含BSA的無血清培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細胞密度至1－10×105,個人認為不要超過5×105。

具體實驗時采用密度要自己摸索,因為不同細胞,其侵襲能力是不同的。個人經(jīng)驗,細胞量過多,穿過膜的細胞會過多過快,如果最后用計數(shù)法統(tǒng)計結(jié)果的話將難以計數(shù)；而過少的話,可能還沒到檢測的時間點,所有的細胞都已穿過,因此最少也要保證在收樣的時候,上室還要有一定量的細胞存在。

個人認為,對照組和處理盡量不要分開計數(shù),因為細胞數(shù)目的差異會嚴重影響實驗結(jié)果。如果需要對細胞預處理而不得不分開計數(shù),那么計數(shù)一定要多重復幾次,力求準確,盡量保證對照組和處理組細胞密度一致。

2.3

接種細胞

①

取細胞懸液100－200μl加入Transwell小室,不同公司的、不同大小的Transwell小室對細胞懸液量有不同要求,請參考說明書。24孔板小室一般200μl。

②

24孔板下室一般加入500μl含F(xiàn)BS或趨化因子的培養(yǎng)基,不同的培養(yǎng)板加的量有不同要求,具體請參考說明書。這里要特別注意的是,下層培養(yǎng)液和小室間常會有氣泡產(chǎn)生,一旦產(chǎn)生氣泡,下層培養(yǎng)液的趨化作用就減弱甚至消失了,在種板的時候要特別留心,一旦出現(xiàn)氣泡,要將小室提起,去除氣泡,再將小室放進培養(yǎng)板。

③

培養(yǎng)細胞：常規(guī)培養(yǎng)12－48h〔主要依癌細胞侵襲能力而定。時間點的選擇除了要考慮到細胞細胞侵襲力外,處理因素對細胞數(shù)目的影響也不可忽視。

以我的課題為例,我使用的藥物不僅會抑制腫瘤細胞侵襲力,還對細胞增殖有明顯抑制。我選擇的藥物濃度是用MTT篩選出的72h的IC50。用這個濃度處理細胞,24h對細胞增殖并無明顯抑制,但24h后,抑制作用就開始出現(xiàn)了。所以,用這個濃度來做Transwell,處理時間也必須限定在24h,否則一旦藥物抑制了細胞增殖或者誘導出凋亡,使處理組細胞數(shù)目少于對照組,那么就難以肯定穿過膜的細胞比對照組少,究竟是由于侵襲被抑制引起,還是處理后細胞數(shù)目本身就比對照組少而引起的了。

時間過長不可以,同樣,過短也不行,因為細胞會有一定量的MMPs儲存,短時間可能侵襲能力不會有太大改變。同時從藥物被吸收進去,進而發(fā)揮作用,影響MMPs表達,到最后釋放到培養(yǎng)基中,還需要一個過程。時間點的選擇可盡量長點,也可選擇多個時間點研究時間依賴效應,但前提是這個時間圍細胞數(shù)目不能有明顯變化。

另外,我看到細胞在小室的形態(tài)不是正常培養(yǎng)貼壁的形態(tài),而是圓形的,仍是懸浮時的形態(tài),不過會聚集成團,所以看到細胞不正常貼壁也不要緊,是正常現(xiàn)象

在培養(yǎng)過程中,膜下會逐漸有少量小氣泡產(chǎn)生,這是正?，F(xiàn)象,可不予處理,但我遇到過培養(yǎng)一段時間后,膜下出現(xiàn)了大氣泡,幸虧及時發(fā)現(xiàn),否則后果將非常嚴重。因此,個人建議,最好接種細胞后1－2h把培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱里拿出來看看,確信沒有大氣泡產(chǎn)生。

2.4

結(jié)果統(tǒng)計

檢測穿過的細胞數(shù)有兩種方法：

2.4.1

直接計數(shù)法

2.4.1.1

"貼壁"細胞計數(shù)

這里所謂的"貼壁"是指細胞穿過膜后,可以附著在膜的下室側(cè)而不會掉到下室里面去。如下圖：

通過給細胞染色,可在鏡下計數(shù)細胞

①

用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室的細胞

②

染色：常用的染色方法有結(jié)晶紫染色、臺靡藍染色、Giemsa染色、木精染色、伊紅染色等。

個人推薦采用0.1%結(jié)晶紫染色,這種方法有如下優(yōu)勢：<1>.

不需要固定細胞,直接染色即可。<2>.

配制簡單方便。<3>.

染色后可以用33%醋酸脫色,將結(jié)晶紫完全洗脫下來,洗脫液可在酶標儀上570nm

測其OD值,間接反映細胞數(shù)。個人認為這是結(jié)晶紫染色最大的優(yōu)勢所在。因為,雖然經(jīng)過準確的細胞計數(shù),往往穿過膜的細胞數(shù)仍難以準確控制,可能某一批實驗穿過的細胞會特別多,以致細胞成堆,這種情況下就難