牛奶中糠氨酸的快速測定方法 拉曼光譜法（征求意見稿）

1T/XJZJXHFW1000X.X—2023牛奶中糠氨酸的快速測定方法拉曼光譜法本標準規(guī)定了拉曼光譜法快速檢測牛奶中糠氨酸的定性、定量檢測技術(shù)方法。本標準適用于生鮮牛乳、巴氏殺菌乳、UHT高溫滅菌乳中糠氨酸的快速檢測。本方法規(guī)定了牛奶中糠氨酸的定量限為100.0μg/L。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。3原理牛乳試樣經(jīng)鹽酸水解后測定蛋白質(zhì)含量，水解液經(jīng)稀釋后直接用于測定。樣品中的糠氨酸分子與表面增強試劑混合后，分子吸附在表面增強納米顆粒上，其拉曼散射信號可增強106倍以上，使用便攜式激光拉曼檢測儀可自動判別其特征峰并定性檢測出糠氨酸。通過對測定的拉曼譜圖進行基線調(diào)整和歸一化處理，應(yīng)用外標法可完成牛乳樣本中糠氨酸的定量分析。4試劑和材料以下所有試劑，除特別注明者外，均為分析純試劑，實驗用水應(yīng)符合GB/T6682中規(guī)定的一級水要求。4.1糠氨酸標準品：CAS19746-33-9，純度大于99.5%。4.2表面增強試劑：金納米溶膠。4.3無機鹽離子團聚劑：1.0M鹽酸溶液。4.4糠氨酸標準儲備溶液（500.0mg/L將糠氨酸標準品按標準品證書提供的肽純度系數(shù)（NetPeptideContent）換算，用3mol/L鹽酸溶液配置成標準儲備液。-20℃條件下可儲存24個月。示例：糠氨酸標準品證書上標注肽純度系數(shù)為69.1%，則稱取7.24mg糠氨酸標準品，用3mol/L鹽酸溶液溶解并定容至10mL，標準儲備液的濃度為500.0mg/L。5儀器和設(shè)備5.1激光拉曼光譜儀。5.2微波消解儀。5.3分析天平：感量0.01g。5.4冷藏冰箱：4℃~10℃。6測定步驟6.1采樣2T/XJZJXHFW1000X.X—2023用于檢測的巴氏殺菌乳和運輸溫度為2℃~6℃,UHT滅菌乳儲存和運輸溫度不高于25℃。按GB/T10111的規(guī)定取不少于250mL樣品，樣品不應(yīng)受到破壞或者再轉(zhuǎn)運和儲藏期間發(fā)生變化。監(jiān)督抽查或仲裁檢驗等采樣應(yīng)到加工廠抽取成品庫的代銷產(chǎn)品，1周內(nèi)測定。6.2樣品制備6.2.1金納米粒子的合成準確量取2.424mL1%的HAuCl4溶液加入50mL水中，加熱煮沸，再加入1.5mL1%的檸檬酸鈉溶液，繼續(xù)加熱30min，冷卻至室溫，即可使用。金納米粒子的掃描電鏡圖和紫外吸收圖參見附錄A中圖A1、2。6.2.2試樣水解液的制備稱量1.0g（準確至0.001g）牛奶樣品于聚四氟乙烯消解管中，并加入10.0mL濃度為8N的鹽酸溶液，使樣品受酸水解，同時做試劑空白實驗。蓋上消解管專用蓋，將消解管安裝至支架上后放入微波消解儀。按表1中升溫程序進行微波消解，消解完成冷卻至室溫后，定容至25.0mL，過0.22μm水相濾膜，濾液供上機測定。表1微波消解程序升溫時間/min消解溫度/℃保持時間/min75555306.3儀器參考條件6.3.1激光波長：785nm6.3.2激光功率：200mW6.3.3積分時間：5秒6.3.4平均次數(shù)：2次6.4定性測定在玻璃測試管中依次加入0.2mL待測液、0.05mL無機鹽團聚劑和0.2mL表面增強試劑，混勻后開始上機檢測。根據(jù)譜圖中904cm-1、1074cm-1、1150cm-1和1453cm-1處特征拉曼光譜，對牛奶中的糠氨酸進行評估：如同時存在上述特征峰，則可判定樣品中含有糠氨酸；否則，不能證明樣品中含有糠氨酸，需要進一步實驗驗證。牛奶中糠氨酸定性測定表面增強拉曼光譜圖參見附錄A中A3。6.5定量測定3T/XJZJXHFW1000X.X—2023對測定的拉曼譜圖進行基線調(diào)整和歸一化處理，操作如下：6.5.1首先將測定的拉曼光譜數(shù)據(jù)進行基線調(diào)整。6.5.2以糠氨酸最強的特征峰1150cm-1作為定量特征峰，對糠氨酸特征拉曼峰進行歸一化處理。6.5.3歸一化后得到的特征拉曼峰的峰面積可根據(jù)當次實驗中糠氨酸標品特征峰測得的標準曲線進行定量。牛奶中糠氨酸定量測定表面增強拉曼光譜圖參見附錄A中A4。7結(jié)果計算按式（1）計算樣品中各農(nóng)藥殘留總量。 式中：X—試樣中中糠氨酸含量，單位為微克每升(μg/L）；c—外標物濃度，單位為微克每毫升(μg/L）；V—樣品定容體積，單位為毫升（mL）；V1—加液體積，單位為毫升（mL）；V2—取液體積，單位為毫升（mL）；A1—樣品峰面積；A—外標峰面積；m—稱取試樣的質(zhì)量，單位為克（g）。8檢測方法靈敏度、準確度、精密度8.1靈敏度：本方法檢出限為0.05mg/L，定量限為0.1mg/L；8.2準確度：本方法在0.5～50.0mg/L添加濃度水平上的回收率為70%～120%；回收添加實驗：將一定標準工作液加入到空白試樣中，按上述6測定步驟進行。牛奶中糠氨酸回收加標實驗拉曼光譜圖參見附錄A中A5。牛奶中糠氨酸添加濃度及其回收率的實驗數(shù)據(jù)：在0.5mg/L時，回收率為72.5%；在5.0mg/L時，回收率為85.5%；在50.0mg/L時，回收率為93.8%；8.3精密度：在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的15%。4T/XJZJXHFW1000X.X—2023（資料性附錄）標準物質(zhì)色譜圖及出峰時間A.1金納米粒子的掃描電鏡微觀結(jié)構(gòu)見圖A.1。圖A.1金納米粒子的掃描電鏡圖A.2金納米粒子的紫外吸收見圖A.2。圖A.2金納米粒子紫外吸收圖5T/XJZJXHFW1000X.X—2023A.3糠氨酸表面增強拉曼光譜見圖A.