反膠束法萃取玉米胚芽蛋白工藝研究

反膠束法萃取玉米胚芽蛋白工藝研究

玉米是去除玉米水分的副產(chǎn)品之一。其蛋白質(zhì)含量約為20%。生物價格的per值接近who-fao的推薦值，與大豆酪氨酸含量相似。這是優(yōu)質(zhì)的植物蛋白資源，但目前玉米中的蛋白質(zhì)資源沒有得到有效利用。反膠束萃取技術(shù)用于蛋白質(zhì)萃取分離最早是在20世紀80年代初期由Gitler和Montal兩位提出,反膠束萃取技術(shù)不同于傳統(tǒng)的堿提酸沉工藝,它具有萃取率高,條件溫和,溶劑可重復利用,成本低,操作簡便,不會引起蛋白質(zhì)變性等優(yōu)點,逐漸成為蛋白質(zhì)分離提取領域人們研究的一個熱點課題。反膠束萃取分離過程一般包括兩步。第一步,前萃取過程,是目標從主體溶液轉(zhuǎn)移至反膠束溶液中的過程;第二步,后萃取過程,是目標從反膠束溶液中轉(zhuǎn)移至第二水相(或以固體的形式游離出來)的過程。本課題組已經(jīng)對反膠束法前萃取玉米胚芽蛋白的工藝進行了研究,得出前萃取最佳工藝條件為:AOT濃度為2.19g/50mL異辛烷、pH值為7.17和溫度38℃,此時脫脂玉米胚芽蛋白前萃率可以達到58.36%。本文重點研究反膠束法后萃取玉米胚芽蛋白的工藝條件,考察萃取時間、pH值和KCl溶液濃度對玉米胚芽蛋白后萃率的影響,通過響應面試驗優(yōu)化工藝條件,意在為反膠束法后萃取脫脂玉米胚芽蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。1試驗材料和方法1.1-乙基己基酯t系聚酰胺基酯嘉善巨楓合成酯脫脂玉米胚芽粉,試驗室自制;AOT(二(2-乙基己基)酯璜酸鈉),嘉善巨楓化工廠;試驗中用到異辛烷、氯化鉀等試劑均為國產(chǎn)分析純。1.2亭科學儀器廠TDL-5-A臺式離心機,上海安亭科學儀器廠;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-5298),上海亞榮生化儀器廠;全自動凱氏定氮儀,瑞士步琪公司。1.3測試方法1.3.1膠束體系前萃液的制備準確稱取一定質(zhì)量的脫脂玉米胚芽粉加入到配制好的AOT反膠束體系中,AOT濃度為2.19g/50mL異辛烷、pH值為7.17,在一定溫度下水浴震蕩2h,在5000r/min下離心20min,取上清液,即為前萃液。1.3.2反膠質(zhì)玉米胚芽粉后萃取一定體積1.3.1所制備的前萃液和具有一定離子強度和pH值的KCl緩沖液按體積比1∶1混合,40℃、200r/min磁力攪拌20min,靜置分層后取下層水相(即為后萃液),測量體積,取5mL后萃液定氮(以未添加脫脂玉米胚芽粉的反膠束后萃取液作為空白對照)。蛋白后萃取率由下式計算:1.3.3kcl溶液濃度對選擇不當溶出液后萃率的影響(1)萃取時間對脫脂玉米胚芽蛋白后萃率的影響。按體積比1∶1將前萃液與pH值10.0的后萃取緩沖液均勻混合,39℃下磁力攪拌一定時間(20、30、40、50和60min),靜置分層后取下層后萃液,測定后萃液蛋白含量并計算蛋白質(zhì)后萃率。(2)KCl溶液濃度對脫脂玉米胚芽蛋白后萃率的影響。按體積比1∶1將前萃液與pH值10.0的后萃取緩沖液均勻混合,后萃取緩沖液KCl溶液濃度分別調(diào)整至0.5、0.75、1.0、1.25和1.5mol/L,其他條件不變,測定后萃液蛋白含量并計算蛋白質(zhì)后萃率。(3)pH值對脫脂玉米胚芽蛋白后萃率的影響。按體積比1∶1將前萃液與后萃取緩沖液均勻混合,后萃取緩沖液KCl溶液濃度調(diào)整至1.0mol/L、pH值調(diào)整為8.5、9.0、9.5、10.0和10.5,其他條件不變,測定后萃液蛋白含量并計算蛋白質(zhì)后萃率。1.3.4響應面優(yōu)化試驗用Box-Behnken試驗設計方案,自變量為萃取時間、KCl溶液濃度和pH值3個因素,響應值為脫脂玉米胚芽蛋白后萃取率,設計為三因素三水平的響應面分析試驗。2結(jié)果與分析2.1萃取時間的影響由圖1可知:萃取時間在20~50min之間時,脫脂玉米胚芽蛋白的后萃取率在不斷增加,在50min處達到最大,繼續(xù)延長萃取時間,脫脂玉米胚芽蛋白的后萃率基本不變,原因可能是隨著萃取過程的進行,水相中蛋白質(zhì)濃度逐漸增加,反膠束極性核中蛋白質(zhì)的量逐漸減小,導致蛋白質(zhì)的傳質(zhì)速率下降,萃取率增加緩慢。綜合考慮,選擇萃取時間為50min。2.2鹽濃度不影響由圖2可知:隨著KCl溶液濃度增加蛋白后萃取率呈現(xiàn)先升后降趨勢,1.0mol/L條件下后萃率有最大值。這可能是因為鹽濃度較低時,反膠團內(nèi)部“水池”中發(fā)生鹽溶效應,促進了蛋白質(zhì)的溶出;當鹽濃度過高時,鹽析作用使得蛋白質(zhì)變性,與AOT疏水尾端結(jié)合幾率增加,從而導致蛋白質(zhì)后萃率下降。因此選取KCl溶液濃度為1.0mol/L。2.3ph值對蛋白后萃率的影響由圖3可知:當pH值在8.5~10.0范圍內(nèi),隨著后萃緩沖液pH值增加,蛋白后萃率逐漸升高至最大值;當pH值>10.0時,蛋白后萃率下降。這可能是由于后萃過程中前萃液與后萃緩沖液等體積混合后,當pH值增大時,后萃取混合體系中離子增加,離子與表面活性劑相互作用機會增加,更多的蛋白分子被從“水池”中釋放出來,使得后萃率增加;當pH值繼續(xù)增大時,雖然釋放出的蛋白質(zhì)增加,但由于環(huán)境pH值偏離等電點,使得蛋白質(zhì)變性析出,導致后萃率下降。因此,后萃取試驗的KCl溶液的pH值取10.0。2.4反膠束法后的玉米提取過程得到優(yōu)化2.4.1玉米胚芽蛋白萃取過程中模型擬合度的變化Box-Behnken試驗設計方案及相應的響應值在表1中給出。由SAS對表1中的試驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合,獲得回歸方程為:回歸方程方差分析結(jié)果由表1可知:模型p=0.0046<0.01,整個模型的R2為0.9626,變異系數(shù)為6.5828,即提取條件的變化對脫脂玉米胚芽蛋白后萃率影響顯著;同時,模型擬合度可以準確的反應自變量間的關系。回歸方程的各項系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果由表2得出:一次項(p<0.01)﹑二次項(p<0.01)對脫脂玉米胚芽蛋白后萃取率的影響均為高度顯著,而交互相作用不顯著(p>0.05)。2.4.2最佳萃取條件的確定由響應面分析可知,X1(萃取緩沖液KCl溶液濃度)和X3(萃取時間)對萃取率影響非常顯著。另外,回歸方程存在極大值點,通過分析可得極大值處編碼值為(0.557372,