大口黑鱸諾卡氏菌病送審稿

PAGE8大口黑鱸諾卡氏菌病診斷和防治技術(shù)規(guī)程范圍本文件規(guī)定了大口黑鱸（Micropterussalmoides）養(yǎng)殖過程中發(fā)生的諾卡氏菌病的流行情況、發(fā)病癥狀、諾卡氏菌的分離培養(yǎng)、形態(tài)學鑒定、生理生化鑒定、16SrRNA基因鑒定、特異性鑒定及該病的防治等技術(shù)規(guī)程。本文件適用于大口黑鱸諾卡氏菌病的診斷和防治。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T14926.43-2001實驗動物細菌學檢測染色法、培養(yǎng)基和試劑GB/T6682-2008分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T27623.1-2011漁用抗菌藥物藥效試驗技術(shù)規(guī)范NY5051-2001無公害食品淡水養(yǎng)殖用水水質(zhì)標準SC/T7014-2006水生動物檢疫實驗室技術(shù)規(guī)范SC/T7103-2008水生動物產(chǎn)地檢疫采樣技術(shù)規(guī)范SC/T1132-2016漁藥使用規(guī)范DB51/T526-2005大口黑鱸養(yǎng)殖技術(shù)規(guī)范食用魚術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1大口黑鱸諾卡氏菌病魚源性諾卡氏菌（Nocardia）包括三個種：鰤諾卡氏菌（Nocardiaseriolae），殺鮭諾卡氏菌（Nocardiasalmonicida）和星狀諾卡氏菌（Nocardiaasteroides），感染大口黑鱸的主要為鰤諾卡氏菌種，本文件中所提及的大口黑鱸諾卡氏菌病均為鰤諾卡氏菌感染引起大口黑鱸發(fā)病或死亡的細菌性疾病。試劑和材料4.1水用水符合GB/T6682-2008中“4.1”一級水規(guī)格。4.2試劑與培養(yǎng)基革蘭氏染液配制按照GB/T14926.43-2001中“3.1”的規(guī)定執(zhí)行，牛腦心浸液培養(yǎng)基（BHI），50×TAE緩沖液，1%X脂糖凝膠，七葉苷培養(yǎng)基、明膠培養(yǎng)基、TE緩沖液等相關(guān)配方見附錄A，細菌基因組DNA提取試劑盒選用專業(yè)試劑公司提供的商品化試劑。4.316SrRNA擴增引物16SrRNA基因DNA序列擴增引物，P-F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，P-R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。4.4特異性鑒定引物特異性鑒定上游引物N5F1：5′-TGAGCCTGAACTGCATGGTTC-3′，下游引物N5R1：5′-ACGGTATCGCAGCCCTCTGTA-3′。設(shè)備和儀器超凈工作臺、光學顯微鏡、PCR儀、電泳儀、離心機、生化培養(yǎng)箱、恒溫搖床培養(yǎng)箱、常規(guī)細菌接種器械（包括培養(yǎng)皿、酒精燈、接種環(huán)、酒精棉等）、-4℃/-20℃冰箱等。臨床檢查6.1流行情況發(fā)病水溫：水溫15-32℃時都可流行，我省在每年4月底開始大規(guī)模爆發(fā)，直至10月均有該病流行，25-28℃為發(fā)病高峰期，死亡率高，進入冬季大口黑鱸停食后死亡率下降。6.2臨床和解剖癥狀患病魚反應遲鈍、離群獨游，食欲下降，主要病變?yōu)轶w表出現(xiàn)潰瘍灶以及出血點，在鰓絲基部、軀干皮下脂肪、肌肉、腹腔（包括肝、腎、脾、魚鰾、腸系膜）出現(xiàn)乳白色或黃色結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)大小通常直徑0.5-3mm，肝臟腫大、淤血，魚鰾腔內(nèi)有積液等。實驗室樣品采集樣品采集按SC/T7013-2008中“4，5，6，7，8”規(guī)定執(zhí)行。細菌的分離與培養(yǎng)用75%酒精棉球?qū)悠敷w表進行擦拭消毒后，無菌操作取肝臟、腎臟和脾臟進行病原菌分離。利用接種環(huán)，劃線接種至BHI固體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)7d，從形態(tài)一致的優(yōu)勢菌群中挑取單個菌落進一步純化培養(yǎng)。細菌的鑒定9.1形態(tài)學鑒定9.1.1菌落形態(tài)分離病原菌在BHI固體培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)7d后觀察菌落形態(tài)。9.1.3細菌形態(tài)革蘭氏染法染色觀察，參照GB/T14926.43-2001中“3.1.5”規(guī)定執(zhí)行。9.2生化特性鑒定9.2.1氧化酶試驗按SC/T7014-2006中“表2”規(guī)定執(zhí)行，菌落呈玫瑰紅色，然后變?yōu)樯钭仙呔鶠殛栃浴?.2.2尿素酶試驗按SC/T7014-2006中“表2”規(guī)定執(zhí)行，紅色為陽性。9.2.3硝酸鹽還原試驗按SC/T7014-2006中“表2”規(guī)定執(zhí)行，紅色為陽性。9.2.4過氧化氫酶試驗挑取單個菌落，置于潔凈的載玻片上，加入3%過氧化氫1-2滴，觀察有無氣泡產(chǎn)生，有氣泡產(chǎn)生者為陽性。9.2.5檸檬酸鹽試驗按SC/T7014-2006中“表2”規(guī)定執(zhí)行，培養(yǎng)基藍色為陽性。9.2.6七葉苷水解試驗將待檢菌接種于七葉苷培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)7d，培養(yǎng)基變?yōu)楹谏珵殛栃?，不變色者為陰性?.2.7明膠液化試驗將待檢菌種接種于明膠培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)7d，明膠液化者為陽性。9.2.8淀粉水解試驗按SC/T7014-2006中“表2”規(guī)定執(zhí)行，呈藍色者為陰性，無藍色者為陽性。9.316SrRNA鑒定9.3.1總DNA提取DNA提取采用商品化的細菌基因組DNA提取試劑盒，按說明書操作。9.3.216SrRNA基因序列擴增將上述提取DNA作為模板，利用“4.3”中的引物擴增16SrRNA序列，反應在25μL體系中進行：PCRPremix12.5μL，上下游引物各1.0μL，2.0μL模板DNA，雙蒸水補足至25μL。反應條件：95℃預變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1.5min，循環(huán)擴增30次；72℃終延伸10min。4℃保存?zhèn)溆谩？瞻讓φ杖〉润w積的雙蒸水代替DNA模板。9.3.3X脂糖凝膠電泳用1×TAE電泳緩沖液配制1%的X脂糖凝膠（含0.5μL/mLEB）平板，凝固后放入水平電泳槽，使泳緩沖液剛好淹沒膠面。將上述擴增產(chǎn)物6μL樣品加入樣品孔，使用DNA分子量標準參照物作對照。120V電泳約15-30min，當指示劑到達底部時停止。于紫外光下觀察電泳條帶，在長波紫外燈下用刀片切下含有目的條帶（約1500bp）的膠塊，放入無菌離心管中稱重。9.3.4PCR擴增產(chǎn)物純化按每0.1gX脂糖凝膠加0.1mL酚，將酚加入上述含有目的條帶膠塊的離心管中。經(jīng)漩渦震蕩儀震蕩1min-2min，將離心管在-70℃放置1h，使凝膠完全凍結(jié)。9.3.4.337℃水浴將凍結(jié)的凝膠融化后，在漩渦震蕩儀上震蕩1min-2min；14000r/min離心5min。9.3.4.4取上層水相轉(zhuǎn)入另一個離心管中，加入等體積的酚：氯仿：異戊醇（25﹕24﹕1），混勻，12000r/min離心5min。9.3.4.5取上清液加入等體積的氯仿：異戊醇（24:1），混勻，12000r/min離心5min。9.3.4.6向收集的水溶液中加入1/10體積的3mol/L的乙酸鈉和2倍體積的無水乙醇，置-20℃過夜或-70℃放置1h-2h。9.3.4.714000r/min離心10min，棄上清。9.3.4.8將沉淀的DNA溶于適當體積的TE緩沖液中，置-20℃保存，待測。9.3.5測序與同源性分析將上述提取的DNA進行測序，并于參考序列（附錄B）進行比對分析。9.4特異性檢測9.4.1特異性基因擴增將“9.3.1”中提取DNA作為模板，并以維氏氣單胞菌基因組DNA作為對照，利用“4.4”中的引物擴增，進行特異性PCR檢測。反應在25μL體系中進行，反應條件：94℃預變性4min；94℃變性1min，58℃退火30s，72℃延伸1.5min，循環(huán)擴增30次；72℃終延伸10min。9.4.2序列檢測PCR產(chǎn)物于1%的X脂糖凝膠電泳進行檢測，觀察片段大小。結(jié)果判定10.1菌落形態(tài)沙粒狀淡黃色菌落，粗糙易碎，邊緣不整齊，在表面形成褶皺。10.2細菌形態(tài)革蘭氏染色呈陽性，鏡檢可見菌體紫色分枝狀。10.3生理生化特性生理生化反應試驗結(jié)果見表1。表1鰤諾卡氏菌生理生化特性檢測項目參照結(jié)果檢測項目參照結(jié)果七葉苷水解+過氧化氫酶+明膠溶解-氧化酶-淀粉水解-脲酶-硝酸鹽還原-檸檬酸鹽+注：“+”表示陽性，“-”表示陰性10.416SrRNA基因序列檢測測定的16SrRNA基因序列與附錄B所列的基因序列比較，同源性達98%以上。10.5特異性檢測預計擴增片段為1069bp。PCR產(chǎn)物于1%的X脂糖凝膠電泳進行檢測，在1000bp條帶處得到預期大小的單一明亮條帶，而作為對照的維氏氣單胞菌無條帶產(chǎn)生，判定為陽性。綜合判定符合以下a）b）c）三條特征的基礎(chǔ)上，d）或者e）特征出現(xiàn)任意一條者判定為大口黑鱸諾卡氏菌病。a）患病大口黑鱸流行情況和發(fā)病癥狀與“6.1”和“6.2”相符；b）所分離病原菌菌落與菌體形態(tài)分別與“10.1”和“10.2”相符；c）生理生化反應結(jié)果與“表1”相符；d）16SrRNA基因序列與附錄B所列的基因序列同源性分析結(jié)果達98%以上。e）分離菌株DNA特異性基因檢測陽性防治方法12.1水質(zhì)使用無諾卡氏菌污染的水源和水系統(tǒng)，養(yǎng)殖用水符合NY5051-2001中“3.2”的規(guī)定。12.2清塘消毒清除池塘過多的淤泥，并經(jīng)冬季陽光曝曬，放養(yǎng)前一個月，每667m2面積用生石灰75kg～100kg，化漿后全池潑灑，以改善池塘底質(zhì)和殺滅病菌。12.3魚苗購入從國家級、省級良種場或經(jīng)國家批準的種苗生產(chǎn)場購買經(jīng)檢疫合格的大口黑鱸魚苗。12.4飼料使用大口黑鱸專用配合飼料，避免經(jīng)常投喂冰鮮野雜魚。12.5日常管理做好投飼及日常管理工作，參照DB51/T526-2005中“4”的規(guī)定執(zhí)行。12.6養(yǎng)殖水體消毒在該病高發(fā)期，可選用復合碘溶液，戊二醛溶液或苯扎溴銨等漁用消毒殺菌藥物全池潑灑進行預防及治療，按照商品說明使用。12.7微生態(tài)制劑調(diào)節(jié)在疾病高發(fā)期，可選用芽孢桿菌、乳酸桿菌和光合細菌全池潑灑，競爭性抑制諾卡氏菌的大量繁殖，按照商品說明使用，但不能與“12.6”中的消毒藥物同時使用，至少間隔三天。12.8敏感抗生素藥物篩選若該病已經(jīng)發(fā)生，參照GB/T27623.1-2011中“5”的規(guī)定篩選敏感抗生素藥物，選用敏感抗生素藥物進行拌料投喂，藥物使用應符合SC/T1132-2016中“6”的要求。

附錄A（規(guī)范性附錄）培養(yǎng)基和試劑配制方法A.1BHI牛腦心浸液固體培養(yǎng)基在800ml雙蒸水中加入37gBHI牛腦心浸液，15-20gX脂粉，混勻，加熱攪拌溶解，調(diào)節(jié)pH值為7.4±0.2，定容至1000ml，121℃高壓滅菌15min。A.250×TAE緩沖液在400mL雙蒸水中溶解121gTris堿，加入28.55mL冰乙酸和50mL0.5mol/LEDTA。再加雙蒸水定容至500mL，室溫保存。使用時，配成1×TAE電泳緩沖液A.31%X脂糖凝膠X脂糖1g中加入1xTAE緩沖液100mL，加熱溶解后，加入5μLGoldenview混勻。A.4七葉苷培養(yǎng)基胰蛋白胨5.0g，磷酸二氫鉀1.0g，七葉苷3.0g，檸檬酸鐵銨0.5g，混勻，加熱攪拌溶解，調(diào)節(jié)pH值為7.4±0.2，定容至1000ml，121℃高壓滅菌15min。A.5明膠培養(yǎng)基NaCI5g，蛋白胨10g，牛肉膏3g，明膠120g，混勻，加熱攪拌溶解，調(diào)節(jié)pH值為7.4±0.2，定容至1000ml，121℃高壓滅菌15min。A.6TE緩沖液800ml雙蒸水中溶解Tris堿1.21g，乙二胺四乙酸二鈉0.372g，調(diào)節(jié)pH為8.0，再加雙蒸水定容至1000mL，室溫保存。A.7酚：氯仿：異戊醇（25:24:1）將25體積的酚、24體積的氯仿和1體積的異戊醇混合即可，室溫貯存于不透光的瓶中，上面加上TE緩沖液，4℃保存。A.8氯仿：異戊醇（24:1）將24體積的氯仿和1體積的異戊醇混合即可，室溫貯存于不透光的瓶中。

附錄B（規(guī)范性附錄）16SrRNA基因參考序列（GeneBank登錄號：JCM3360）1ttaacacatgcaagtcgagcggtaaggcccttcggggtacacgagcggcgaacgggtgag61taacacgtgggtgatctgccttgcactctgggataagcctgggaaactgggtctaatacc121ggatatgagcctgaactgcatggttcgggttggaaagatttatcggtgcgagatgggccc181gcggcctatcagcttgttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgacgggtagccggcc241tgagagggcgaccggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagc301agtggggaatattgcacaatgggcgaaagcctgatgcagcgacgccgcgtgagggatgac361ggccttcgggttgtaaacctctttcgacagggacgaagcgcaagtgacggtacctgtaga421agaagcaccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggtgcgagcgttgtc481cggaatgactgggcgtaaagagcttgtaggcggtctgtcacgtcggtcgtgaaaactcac541agctcaactgtgggcctgcggtcgatacgggcagactagagtacttcaggggagactgga601attcctggtgtagcggtgaaatgcgcagatatcaggaggaacaccggtggcgaaggcggg661tctctgggaagtaactgacgctgagaagcgaaagcgtgggtagcgaacaggattagatac721cctggtagtccacgccgtaaacggtgggtactaggtgtgggtttccttccacgggatccg781tgccgtagctaacgcattaagtaccccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactca841aag