利用烏骨雞產(chǎn)蛋白酶解花青素的工藝研究

利用烏骨雞產(chǎn)蛋白酶解花青素的工藝研究

烏骨雞是世界上罕見的珍稀鳥類。它集藥物、補(bǔ)充和營(yíng)養(yǎng)于一體，對(duì)人體具有特殊的營(yíng)養(yǎng)功能。烏骨雞與普通雞最明顯的差異就是含有黑色素。研究表明,烏骨雞中的黑色素具有保護(hù)功效,可以避免紫外線引起的急慢性改變;具有清除自由基,抗氧化等功能,從而可以預(yù)防癌癥,抗衰老,提高肌體的免疫力。由于烏骨雞黑色素與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起,對(duì)于烏骨雞黑色素的分離,主要采用鹽酸降解蛋白質(zhì)的方法,其他方法尚未見報(bào)道,但是該法可能造成黑色素形態(tài)和化學(xué)結(jié)構(gòu)的損傷。本實(shí)驗(yàn)擬采用蛋白酶法分離黑色素,并對(duì)黑色素的抗氧化性能進(jìn)行了研究,旨在找出酶法分離烏骨雞黑色素的最佳工藝條件,為烏骨雞食品的開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。1材料和方法1.1試驗(yàn)材料泰和烏骨雞:購(gòu)自江西省泰和縣生物谷食品科技工業(yè)園;大豆色拉油(市售),DPPH(sigma)。1.2堿性蛋白酶和果汁活性537酸性蛋白酶、1398中性蛋白酶、HAP堿性蛋白酶(酶活力均≧10萬單位,上海酶制劑廠);木瓜蛋白酶(酶活力≧6000萬單位,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。所用化學(xué)試劑均為分析純。1.3烏骨雞黑色素提取工藝全凈膛烏雞→清洗→剔骨取肉→絞碎→加酶、調(diào)pH、恒溫水解→酶水解液→離心→濾渣→清洗→黑色素1.4實(shí)驗(yàn)計(jì)劃1.4.1最佳酶解工藝確定參照文獻(xiàn),稱取一定量絞碎混勻的烏雞肉進(jìn)行酶解實(shí)驗(yàn),根據(jù)水解液中氨基態(tài)氮含量確定試驗(yàn)用酶種類。采用黃金分割法,依據(jù)水解液中氨基態(tài)氮含量確定最佳酶解工藝條件。酶解后將水解液離心(5000r/min,20min),沉淀物用醚、蒸餾水反復(fù)洗滌(至少4次),經(jīng)真空冷凍干燥得黑色素。1.4.2抗黑色素酶測(cè)定黑色素對(duì)DPPH·的清除能力;同時(shí)將黑色素添加到油脂中,根據(jù)酸價(jià)變化間接測(cè)定其抗氧化性能。1.5測(cè)量1.5.1氨基氮的測(cè)定1.5.2dppha/l的測(cè)定DPPH·法。將黑色素配成以下濃度:0.05mg/mL,0.1mg/mL,0.2mg/mL,0.25mg/mL,0.3mg/mL,0.4mg/mL,DPPH·用95%乙醇配成1×10-4mol/L的溶液,向2mLDPPH·溶液中加入2mL樣品溶液,總體積為4mL,搖勻,于25℃水浴中放置30min后倒入光徑為1cm的比色皿,記錄517nm吸光值為A樣品(用2mL95%乙醇與2mL樣品液調(diào)0點(diǎn),以扣除試劑本身顏色的影響),向2mLDPPH·溶液中加2mL相應(yīng)樣品溶劑,記錄吸光值為A空白,即空白對(duì)照。抑制率計(jì)算公式:抑制率η(%)=(A空白—A樣品)/A空白×100%1.5.3油酸價(jià)測(cè)定酸堿中和法。2結(jié)果與分析2.1烏雞肉蛋白質(zhì)的水解選用537酸性蛋白酶、1398中性蛋白酶、HAP堿蛋白酶、木瓜蛋白酶4種蛋白酶,按固液比(烏雞肉∶水=1∶4,酶解時(shí)間4h,酶用量(相對(duì)于烏雞肉重的質(zhì)量分?jǐn)?shù))2%,在各自的適宜反應(yīng)條件下,水解烏雞肉,測(cè)定水解液中氨基態(tài)氮含量(經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí),烏雞肉中黑色素質(zhì)量與水解液中氨基態(tài)氮含量之間高度線性相關(guān),其相關(guān)系數(shù)達(dá)0.9939,因此,為了研究方便,采用水解液中氨基態(tài)氮含量來間接反映烏雞肉中的黑色素的含量)。結(jié)果見表1。由表1可知,4種蛋白酶對(duì)烏雞蛋白質(zhì)的水解效果不同,酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶對(duì)烏雞肉有較強(qiáng)的水解能力,分別達(dá)到0.2644g/100mL、0.2403g/100mL;堿性蛋白酶水解能力最差,只有0.0565g/100mL。由于酸性蛋白酶酶解條件溫和(30～50℃),便于水解操作,因而將其選為水解烏雞肉蛋白質(zhì)用酶。2.2酶解條件的確定2.2.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論取pH3.0,溫度40℃,固液比1∶4,酶解時(shí)間4h,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2可知,在固定底物下,氨基態(tài)氮含量隨加酶量的增加而增加,但加酶量達(dá)到3.8%以后,不再增加,說明底物可能已被酶飽和,因而加酶量可確定為3.8%。2.2.2不同黃金分割法確定最佳酶解溫度的確定已知酸性蛋白酶作用范圍在30～50℃,根據(jù)黃金分割法確定最佳酶解溫度的試驗(yàn)點(diǎn),其結(jié)果見表3。從表3可知,溫度為34.8℃為最佳酶解溫度。2.2.3黃金分割法確定最適ph已知537酸性蛋白酶在pH2.0～4.0之間穩(wěn)定,超過此范圍,失活較嚴(yán)重,由黃金分割法,在pH2.0～4.0含優(yōu)區(qū)間內(nèi)找出最適pH,經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)得最適pH=2.8(表4)。2.2.4氮含量對(duì)水解能力的影響在相同條件下,底物濃度不同,其水解效果亦有差異(表5)。由表5可知,固液比為1∶2時(shí),氨基態(tài)氮含量最多,水解能力最強(qiáng),超過或低于這一值時(shí),水解能力均降低。當(dāng)?shù)孜餄舛仍龃髸r(shí)黏度也增大,影響酶分子的擴(kuò)散和定向,不利于酶與底物充分接觸,因而酶水解能力降低;另一方面,底物濃度減小,則影響了酶與底物的接觸頻率。所以底物濃度過大過小都不利于酶水解。因此,固液比采用1∶2為宜。2.2.5分流酶加入實(shí)驗(yàn)加酶量也是影響水解的因素之一。當(dāng)?shù)孜餄舛纫欢〞r(shí),加酶量過大,可能導(dǎo)致酶本身相互水解,使酶活力降低。本實(shí)驗(yàn)中其他條件一定,采用分批分次加入酶的方式。由表6可見,在不增加酶用量的情況下,采用分兩次加入酸性蛋白酶對(duì)烏雞肉進(jìn)行水解效果更加理想。2.2.6不同酶解時(shí)間對(duì)水解液氨基態(tài)氮的影響利用酸性蛋白酶在最佳條件下水解烏雞肉,每隔2h測(cè)定其水解液中氨基氮含量,其結(jié)果見圖1。由圖1中可見,在0～20h之間,隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),水解液中氨基態(tài)氮呈上升趨勢(shì),當(dāng)達(dá)到20h時(shí),水解液中氨基態(tài)氮含量最高,達(dá)0.4736g/100mL,水解能力最強(qiáng),20h以后水解液中氨基態(tài)氮含量幾乎不再增加,這可能與酶的活性下降有關(guān)。因而,可選定酶解時(shí)間為20h。2.3清除dpph的能力根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì),測(cè)定其清除DPPH·自由基的能力,其結(jié)果見圖2。圖2表明,當(dāng)黑色素濃度為1×10-4g/mL時(shí),對(duì)DPPH·就具有較大的清除能力,其反應(yīng)抑制率達(dá)70.98%,當(dāng)達(dá)到0.3mg/mL濃度時(shí),抑制率高達(dá)90.10%。徐幸蓮等研究發(fā)現(xiàn)烏雞黑色素具有很強(qiáng)的清除O-2·的能力。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),黑色素亦具有較強(qiáng)的清除DPPH·的能力,這也說明了黑色素具有驚人的物化反應(yīng)特性,能夠有效地與活性物質(zhì)作用,如羥自由基和水合離子,單線態(tài)氧、超氧離子等。2.4不同處理?xiàng)l件對(duì)油脂酸價(jià)的影響為了進(jìn)一步驗(yàn)證黑色素的其他物化反應(yīng)特性和在食品中的抗氧化效果,設(shè)計(jì)如下實(shí)驗(yàn),取150g色拉油2份,向其中加入0.05mg/mL,0.1mg/mL二種濃度的黑色素液,于70℃恒溫干燥箱中,進(jìn)行加速氧化分解試驗(yàn),同時(shí)以不加黑色素者為空白對(duì)照,每隔4h取樣測(cè)定油脂的酸價(jià),比較其結(jié)果(圖3)。由圖3可知,黑色素對(duì)油脂酸價(jià)有明顯的抑制作用,其抑制的最小濃度為0.1mg/mL。從油脂酸價(jià)變化曲線來看,經(jīng)70℃,32h的恒溫處理后,添加0mg/mL和0.05mg/mL兩種黑色素濃度的油脂已經(jīng)發(fā)生酸敗,酸價(jià)分別達(dá)到0.3169mgKOH/g、0.3130mgKOH/g,而添加0.1mg/mL濃度的油脂酸價(jià)只有0.1941mgKOH/g,仍在國(guó)標(biāo)規(guī)定(0.30mgKOH/g)的范圍之內(nèi),60h以后酸價(jià)才達(dá)到0.3028mgKOH/g,開始出現(xiàn)酸敗現(xiàn)象,這比對(duì)照的貯藏期幾乎延長(zhǎng)一倍時(shí)間。這與前面所述的黑色素的抗氧性實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致,說明黑色素具有較強(qiáng)的抑制油脂酸敗的能力。3烏骨雞工況及用量(1)酸性蛋白酶水解烏雞肉能力最強(qiáng);水解底物的固液比1∶2,加酶量為雞肉質(zhì)量的3.8%;其最佳酶解條件為:溫度34.8℃pH2.8,酶解時(shí)間20h;在加酶