基因工程 課件 酶工程

食品酶工程1主要內(nèi)容食品酶工程概述酶的生產(chǎn)與改造酶的固定化及其生產(chǎn)應(yīng)用技術(shù)酶工程在食品工業(yè)中的應(yīng)用2前言早在幾千年我們的祖先就曾有釀酒、制醋、做醬的記載,所有這些,實(shí)際上都是酶知識(shí)的應(yīng)用?，F(xiàn)在，酶工程已在醫(yī)藥、食品、工業(yè)、農(nóng)業(yè)、飼料、環(huán)保、能源、科研等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。種類繁多的藥品，如抗生素、維生素等1

基因工程藥品：如人生長(zhǎng)素、乙肝疫苗、單抗等2

微生物發(fā)酵藥品：如人胰島素、干擾素等3一、酶工程技術(shù)在醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用酶學(xué)研究簡(jiǎn)史1878德國(guó)的Kuhne

定義Enzyme原意為在酵母中1926美國(guó)的Sumner從刀豆中得到脲酶結(jié)晶（1947年諾貝爾獎(jiǎng)）1970美國(guó)的Smith發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶（1979年諾貝爾獎(jiǎng)）1969日本固定化氨基?；?，第一次將固定化酶成功地應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。——酶工程誕生1986美國(guó)核酶發(fā)現(xiàn)獲得諾貝爾獎(jiǎng)6

概念：酶工程（EnzymeEngineering）又稱酶技術(shù)，是指酶的大批量生產(chǎn)以及利用酶、細(xì)胞器或細(xì)胞所具有的特異催化功能，或?qū)γ附Y(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾改造，通過適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)器，并借助于工程技術(shù)手段，有效地發(fā)揮酶的催化特性來生產(chǎn)人們所需產(chǎn)品或達(dá)到某種特殊目的的技術(shù)。7研究?jī)?nèi)容（一）酶的產(chǎn)生

酶制劑的來源有微生物、動(dòng)物和植物，也有人工合成酶。但是主要的來源是微生物。由于微生物比動(dòng)植物具有更多的優(yōu)點(diǎn)，因此，一般選用優(yōu)良的產(chǎn)酶菌株，通過發(fā)酵來產(chǎn)生酶。為了提高發(fā)酵液中的酶濃度，選育優(yōu)良菌株、研制基因工程菌、優(yōu)化發(fā)酵條件。工業(yè)生產(chǎn)需要特殊性能的新型酶，如耐高溫的α—淀粉酶、耐堿性的蛋白酶和脂肪酶等，因此，需要研究、開發(fā)生產(chǎn)特殊性能新型酶的菌株。8研究?jī)?nèi)容（二）酶的提取分離

酶的分離提純技術(shù)是當(dāng)前生物技術(shù)“后處理工藝”的核心。采用各種分離提純技術(shù)，從微生物細(xì)胞及其發(fā)酵液，或動(dòng)、植物細(xì)胞及其培養(yǎng)液中分離提純酶，制成高活性的不同純度的酶制劑，為了使酶制劑更廣泛地應(yīng)用于國(guó)民經(jīng)濟(jì)各個(gè)方面，必須提高酶制劑的活性、純度和收率，需要研究新的分離提純技術(shù)。10研究?jī)?nèi)容（三）酶和細(xì)胞固定化

酶和細(xì)胞固定化研究是酶工程的中心任務(wù)。為了提高酶的穩(wěn)定性，重復(fù)使用酶制劑，擴(kuò)大酶制劑的應(yīng)用范圍，采用各種固定化方法對(duì)酶進(jìn)行固定化，制備了固定化酶，如固定化葡萄糖異構(gòu)酶、固定化氨基?；傅?，測(cè)定固定化酶的各種性質(zhì)，并對(duì)固定化酶作各方面的應(yīng)用與開發(fā)研究。11研究?jī)?nèi)容（三）酶和細(xì)胞固定化

固定化細(xì)胞是在固定化酶的基礎(chǔ)發(fā)展起來的。用各種固定化方法對(duì)微生物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞進(jìn)行固定化，制成各種固定化生物細(xì)胞.研究固定化細(xì)胞的酶學(xué)性質(zhì)，特別是動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，研究與開發(fā)固定化細(xì)胞在各方面的應(yīng)用，是當(dāng)今酶工程的一個(gè)熱門課題。12研究?jī)?nèi)容（四）酶分子修飾

又稱為酶分子修飾。為了提高酶的穩(wěn)定性，降低抗原性，延長(zhǎng)藥用菌在機(jī)體內(nèi)的半衰期，采用各種修飾方法對(duì)酶分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，以便創(chuàng)造出天然酶所不具備的某些優(yōu)良特性(如較高的穩(wěn)定性、無抗原性、抗蛋白酶水解等)，甚至于創(chuàng)造出新的酶活性，擴(kuò)大酶的應(yīng)用，從而提高酶的應(yīng)用價(jià)值，達(dá)到較大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。13研究?jī)?nèi)容（五）有機(jī)介質(zhì)中的酶反應(yīng)

由于酶在有機(jī)介質(zhì)中的催化反應(yīng)具有許多優(yōu)點(diǎn)。因此，近年來，酶在有機(jī)介質(zhì)中催化反應(yīng)的研究，已受到不少人的重視，成為酶工程中一個(gè)新的發(fā)展方向。酶在有機(jī)介質(zhì)中要呈現(xiàn)很高的活性，必須具備哪些條件？有機(jī)介質(zhì)對(duì)酶的性質(zhì)有哪些影響？如何影響？近年來，對(duì)這些問題的研究，已取得重要進(jìn)展。14研究?jī)?nèi)容（六）酶?jìng)鞲衅?/p>

又稱為酶電極。酶電極是由感受器(如固定化酶)和換能器(如離子選擇性電極)所組成的一種分析裝置，用于測(cè)定混合物溶液中某種物質(zhì)的濃度，其研究?jī)?nèi)容包括：酶電極的種類、結(jié)構(gòu)與原理；酶電極的制備、性質(zhì)及應(yīng)用。15研究?jī)?nèi)容（七）酶反應(yīng)器

酶反應(yīng)器是完成酶促反應(yīng)的裝置。其研究?jī)?nèi)容包括：酶反應(yīng)器的類型及特性；酶反應(yīng)器的設(shè)計(jì)、制造及選擇等。16研究?jī)?nèi)容（七）酶反應(yīng)器抗體酶是一類具有催化活性的抗體。是抗體的高度專一性與酶的高效催化能力二者巧妙結(jié)合的產(chǎn)物。其研究?jī)?nèi)容是：抗體酶的制備、結(jié)構(gòu)、特性、作用機(jī)理、催化反應(yīng)類型、應(yīng)用等。人工酶是用人工合成的具有催化活性的多肽或蛋白質(zhì)。據(jù)1977年Dhar等人報(bào)道，人工合成的Glu—Phe—Ala—Glu—Glu—Ala—Ser—Phe八肽具有溶菌酶的活性。其活性為天然溶菌酶的50%。17研究?jī)?nèi)容（八）酶反應(yīng)器利用有機(jī)化學(xué)合成的方法合成了一

些比酶結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單得多的具有催化功能的非蛋白質(zhì)分子。這些物質(zhì)分子可以模擬酶對(duì)底物的結(jié)合和催化過程。既可以達(dá)到酶催化的高效率，又能夠克服酶的不穩(wěn)定性。這樣的物質(zhì)稱為模擬酶。用環(huán)糊精已成功地模擬了胰凝乳蛋白酶等多種酶。18研究?jī)?nèi)容（九）酶技術(shù)的應(yīng)用在醫(yī)學(xué)、食品、發(fā)酵、紡織、制革、化學(xué)分析、氨基酸合成、有機(jī)酸合成、半合成抗生素合成、能源開發(fā)以及環(huán)境工程等方面的應(yīng)用都很廣泛。①運(yùn)用酶技術(shù)生產(chǎn)有重要價(jià)值的產(chǎn)品。②利用酶制劑改進(jìn)生產(chǎn)工藝，提高產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)率，降低生產(chǎn)成本。1920酶生產(chǎn)酶的生物合成酶的分離酶的純化第二節(jié)酶生產(chǎn)與修飾21酶生產(chǎn)與修飾提取分離法

22生物合成法

生物合成法

24

1949年，日本千畑一郎成功的用細(xì)菌液體深層發(fā)酵法生產(chǎn)出了α-淀粉酶，從此酶制劑的生產(chǎn)逐步轉(zhuǎn)向以微生物發(fā)酵生產(chǎn)酶?；瘜W(xué)合成法

25化學(xué)合成法

26微生物發(fā)酵法產(chǎn)酶的優(yōu)點(diǎn)：（1）微生物種類多，酶種豐富，且菌株易誘變，菌種多樣（2）微生物生長(zhǎng)繁殖快，酶易提取，特別是胞外酶（3）來源廣泛，價(jià)格便宜（4）微生物易得，生長(zhǎng)周期短27微生物發(fā)酵法產(chǎn)酶的優(yōu)點(diǎn)：（5）可以利用微電腦技術(shù)控制酶的發(fā)酵生產(chǎn)，可進(jìn)行連續(xù)化，自動(dòng)化，經(jīng)濟(jì)效益高（6）可以利用以基因工程為主的分子生物學(xué)技術(shù)，選育和改造菌種，增加產(chǎn)酶率和開發(fā)新酶種。28微生物發(fā)酵法產(chǎn)酶的優(yōu)點(diǎn)：4、微生物具有較強(qiáng)的適應(yīng)性和應(yīng)變能力，可以通過適應(yīng)、誘變、基因工程、細(xì)胞融合等方法培育出高產(chǎn)量的菌種。從微生物中獲得的酶有：α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、異淀粉酶。29安全可靠，非致病菌，不產(chǎn)生毒素或其他生理活性物質(zhì)，這樣才能確保酶生產(chǎn)和應(yīng)用的安全。能利用廉價(jià)原料且良好生長(zhǎng)產(chǎn)酶性能穩(wěn)定，菌株不易退化，不易受噬菌體侵襲繁殖快，產(chǎn)酶量高，有利于縮短生產(chǎn)周期。產(chǎn)生的酶容易分離純化產(chǎn)酶微生物：細(xì)菌、放線菌、霉菌、酵母菌301、產(chǎn)酶微生物培養(yǎng)基原料（1）碳源（2）氮源（3）碳氮比（4）無機(jī)鹽（5）生長(zhǎng)因子（6）產(chǎn)酶促進(jìn)劑：誘導(dǎo)物+表面活性劑312、酶的發(fā)酵技術(shù)控制培養(yǎng)方法（1）固體培養(yǎng)法麩曲培養(yǎng)法：淺盤法、轉(zhuǎn)筒法、厚層通氣法（2）液體培養(yǎng)法液體表面培養(yǎng)、液體深層培養(yǎng)323、酶的發(fā)酵技術(shù)控制微生物發(fā)酵條件的控制（1）溫度

332、酶的發(fā)酵技術(shù)控制微生物發(fā)酵條件的控制（2）pH

343、酶的發(fā)酵技術(shù)控制微生物發(fā)酵條件的控制（3）通風(fēng)量

353、酶的發(fā)酵技術(shù)控制微生物發(fā)酵條件的控制（4）攪拌（5）泡沫（6）濕度

363、酶的發(fā)酵技術(shù)控制一般過程：破碎細(xì)胞（或不破碎細(xì)胞）→溶劑抽提→離心→過濾→濃縮→干燥或結(jié)晶

374、微生物酶制劑的提取和精制二、酶修飾

酶的分子修飾原因（不足）1．穩(wěn)定性不夠，不能適應(yīng)大量生產(chǎn)的需要。2．作用的最適條件不符（pH）。3．酶的主要?jiǎng)恿W(xué)性質(zhì)的不適應(yīng)。4．臨床應(yīng)用的特殊要求（具有抗原性）。38二、酶修飾

（一）酶化學(xué)修飾的方法

廣義：涉及共價(jià)鍵或部分共價(jià)鍵的形成或破壞的轉(zhuǎn)變，從而改變酶的酶學(xué)性質(zhì)。

狹義：在溫和的條件下，以可以控制的方式使酶同某些化學(xué)試劑特異反應(yīng)，從而引起單個(gè)氨基酸殘基或其功能發(fā)生共價(jià)的化學(xué)變化酶工程要求：酶活力保持不變或損失不多，同時(shí)具備新的特性和功能。39二、酶修飾

（一）酶化學(xué)修飾的方法

修飾劑：通過集團(tuán)的特性，使被修飾分子化學(xué)集團(tuán)引入或除去而使酶蛋白共價(jià)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變（側(cè)鏈集團(tuán)的取代、肽鏈的限制性水解、分子內(nèi)或分子間的交聯(lián)）或者使化學(xué)分子側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生結(jié)構(gòu)性的改變的物質(zhì)。40

1、酶分子的主鏈修飾主鏈：肽鏈和核苷酸鏈利用酶分子主鏈的切斷和連接，使酶分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的特性和功能的方法。酶蛋白主鏈修飾主要是靠酶切/酶原激活法。（切除一部分，不影響催化活性，但抗原性改變）41（一）酶分子的化學(xué)修飾

2、酶分子的側(cè)鏈修飾組成蛋白質(zhì)的氨基酸殘基上的功能團(tuán)修飾方法：氨基修飾、羧基修飾、巰基修飾、胍基修飾、酚基修飾、咪唑基修飾、吲哚基修飾。α-胰凝乳蛋白酶表面的氨基修飾成親水性更強(qiáng)的-NHCH2COOH,酶活力在60℃提高1000倍。42（一）酶分子的化學(xué)修飾

3、大分子結(jié)合修飾（有機(jī)大分子）最重要的修飾方法之一。顯著提高酶活、增強(qiáng)穩(wěn)定性、降低抗原性。蛋白分子構(gòu)象發(fā)生改變。水溶性大分子修飾劑：右旋糖酐、聚乙二醇、肝素、聚蔗糖β-環(huán)糊精、殼聚糖、白蛋白、明膠、淀粉、聚氨基酸。43（一）酶分子的化學(xué)修飾4、金屬離子置換修飾酶分子中含有金屬離子，往往是活性中心的組成部分。如：α-淀粉酶的Ca2+。將金屬離子置換，可提高酶活力、增強(qiáng)穩(wěn)定性，但也有是酶活性降低，甚至失活。44（一）酶分子的化學(xué)修飾5、酶分子的組成單位置換修飾酶分子的基本單位包括：氨基酸和核苷酸。酶分子的組成單位置換修飾方法主要通過遺傳工程的手段來進(jìn)行的。（定點(diǎn)突變技術(shù)）45（一）酶分子的化學(xué)修飾

物理方法：高溫、高壓、高鹽、真空使空間構(gòu)象發(fā)生改變，從而改變酶的特性和功能。酶的共價(jià)鍵不改變。只是副鍵變化和重排。46（二）酶分子的物理修飾（1）熱穩(wěn)定性（提高）固定酶的分子構(gòu)象；（2）抗原性（PEG，部分消除）人血清蛋白；（3）體內(nèi)半衰期（延長(zhǎng)）；（4）最適pH；（5）酶學(xué)性質(zhì)的改變（米氏常數(shù)Km）；47（三）修飾酶的性質(zhì)及特點(diǎn)

（6）對(duì)組織的分布能力變化（血液里靶器官選擇性吸收）；（7）對(duì)各類失活因子（蛋白酶、抑制劑）的抵抗力提高。48（三）修飾酶的性質(zhì)及特點(diǎn)第三節(jié)酶和細(xì)胞的固定化技術(shù)固定化酶固定化酶與自由酶的概念

自由酶

(FreeEnzyme)

酶直接加入至溶液中，酶自身的空間結(jié)構(gòu)不發(fā)生改變，保持自己的生物特性固定化酶

(ImmobilizedEnzyme)

通過物理或化學(xué)的手段，將酶固載在某種基體上。50固定化酶的優(yōu)點(diǎn)（1）固定化酶可以多次使用，而且在多數(shù)情況下，酶的穩(wěn)定性提高。（2）固定化酶極易與底物、產(chǎn)物分開，因而產(chǎn)物溶液中，沒有酶的殘留，簡(jiǎn)化了提純工藝，產(chǎn)率較高，產(chǎn)品質(zhì)量較好。（3）固定化酶的反應(yīng)條件易于控制，可以裝柱（塔）連續(xù)反應(yīng)，宜于自動(dòng)化生產(chǎn)，節(jié)約勞動(dòng)力，減少反應(yīng)器占地面積。固定化酶的優(yōu)點(diǎn)（4）較水溶性酶更適合于多酶反應(yīng)。（5）輔酶固定化和輔酶再生技術(shù)，將使固定化酶和能量再生體系或氧化還原體系合并使用，從而擴(kuò)大其應(yīng)用范圍。（6）增加產(chǎn)物的收得率，提高產(chǎn)物質(zhì)量。固定化酶的缺點(diǎn)

（1）固定化酶所用載體與試劑較貴、成本高、工廠投資大，加上固定化過程中酶活力有損失，即酶活力回收率低，更增加了工業(yè)化生產(chǎn)的投資困難。如果用胞內(nèi)酶進(jìn)行固定化，還要增加酶的分離成本。固定化酶在長(zhǎng)期使用后，因染雜菌，酶的滲漏，載體降解以及其它錯(cuò)誤操作，也會(huì)致使酶失活。53固定化酶的缺點(diǎn)

（2）固定化酶一般只適用于水溶性的小分子底物；大分子底物常受載體阻攔，不易接觸酶，致使催化活力難以發(fā)揮。（3）目前固定化酶尚限于單級(jí)反應(yīng)，多酶反應(yīng)，特別是需要輔因子的固定化酶技術(shù)，還有待開發(fā)。54制備原則1、必須注意維持酶的構(gòu)象，特別是活性中心構(gòu)象（關(guān)鍵氨基酸殘基不被固定；高級(jí)結(jié)構(gòu)，條件溫和）2、酶與載體必須有一定的結(jié)合程度（構(gòu)象不影響）3、固定化應(yīng)有利于自動(dòng)化、機(jī)械化操作4、固定化酶應(yīng)有最小的空間位阻5、固定化酶應(yīng)有最大的穩(wěn)定性6、固定化酶的成本適中固定化酶的方法

56吸附法包埋法共價(jià)結(jié)合法交聯(lián)法物理吸附法離子吸附法酶直接交聯(lián)法酶輔助蛋白交聯(lián)吸附交聯(lián)法交聯(lián)包埋法交聯(lián)酶聚集體定向/共固定58固定化酶的性質(zhì)1、固定化酶活性比天然酶的活力低的原因：①酶活性中心的重要氨基酸殘基與水不溶性載體相結(jié)合②酶與載體結(jié)合時(shí)，酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，其構(gòu)象的改變導(dǎo)致酶與底物結(jié)合能力或催化底物轉(zhuǎn)化能力的改變③酶被固定化后，雖不失活，但酶與底物間相互作用受到空間位阻的影響；固定化酶的性質(zhì)1、固定化酶活性也有酶經(jīng)固定化活性升高的，可能是因?yàn)楣潭ɑ竺傅牡挚鼓芰μ岣呤沟盟炊扔坞x酶活力高；固定化酶的性質(zhì)2、固定化酶穩(wěn)定性穩(wěn)定性增高的表現(xiàn)：（1）操作穩(wěn)定性，固定化酶在操作中可以長(zhǎng)時(shí)間保留活力，一般情況下，半衰期在一個(gè)月以上，即有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。（2）貯藏穩(wěn)定性，固定化可延長(zhǎng)酶的貯藏有效期。（3）熱穩(wěn)定性，大多數(shù)酶在固定化之后，其熱穩(wěn)定性都有所提高。固定化酶的性質(zhì)2、固定化酶穩(wěn)定性穩(wěn)定性增高的表現(xiàn)：（4）對(duì)蛋白酶的穩(wěn)定性，酶經(jīng)固定化后，其對(duì)蛋白酶的抵抗力提高。（5）酸堿穩(wěn)定性，多數(shù)固定化酶的酸堿穩(wěn)定性高于游離酶，穩(wěn)定pH范圍變寬。3、固定化酶反應(yīng)特性1）底物特異性。底物為小分子化合物時(shí)，固定化酶的底物特異性大多數(shù)情況下不發(fā)生改變。底物為大分子化合物時(shí)，一般隨著底物分子量的增加，固定化酶的活力下降。3、固定化酶反應(yīng)特性2）反應(yīng)的最適pH。酶被固定后，載體如帶負(fù)電荷，最適pH比游離酶的最適pH高（向堿性方向移動(dòng)）；載體如帶正電荷，最適pH比游離酶的最適pH低（向酸性方向移動(dòng)）。3、固定化酶反應(yīng)特性3）反應(yīng)的最適溫度。固定化酶的最適反應(yīng)溫度多數(shù)比游離酶高；最適溫度會(huì)受固定化方法和固定化載體的影響。3、固定化酶反應(yīng)特性4）米氏常數(shù)。Km是反映酶與底物的親和力。蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)和載體電荷可導(dǎo)致酶與底物的親和力發(fā)生變化3、固定化酶反應(yīng)特性5）最大反應(yīng)速度。固定化酶的最大反應(yīng)速度與游離酶大多數(shù)是相同的。三、影響固定化酶性質(zhì)的因素1、酶本身的變化活性中心的氨基酸殘基、高級(jí)結(jié)構(gòu)和電荷狀態(tài)等發(fā)生變化。2、載體的影響分配效應(yīng)、空間障礙效應(yīng)和擴(kuò)散限制效應(yīng)。3、固定化方法的影響四、固定化活細(xì)胞酶反應(yīng)器與酶?jìng)鞲衅髅阜磻?yīng)器的概念

指以酶作為催化劑進(jìn)行反應(yīng)所需的設(shè)備，是游離酶、固定化酶或固定化細(xì)胞催化反應(yīng)的容器。反應(yīng)器的作用

以盡可能低的成本，按一定的速度由規(guī)定的反應(yīng)物制備特定產(chǎn)物。72常見酶反應(yīng)器的特點(diǎn)與類型

按幾何形狀和結(jié)構(gòu)來分，可分為罐型、管型、膜或片型幾種。按進(jìn)料和出料的方式可分為分批式、半分批式與連續(xù)式反應(yīng)器。按其功能結(jié)構(gòu)可分為膜反應(yīng)器、液固反應(yīng)器及氣液固三相反應(yīng)器三大類。737475間歇式攪拌罐

又稱分批式攪拌罐，由容器、攪拌器的恒溫裝置組成。酶的底物一次性加入反應(yīng)器，而產(chǎn)物一次性取出。該反應(yīng)器結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，造價(jià)較低，適于小規(guī)模試驗(yàn)。但是反應(yīng)效率低，攪拌槳的剪切易使固定化酶顆粒受到磨損、破碎，容易造成酶失活，游離酶不能回收，操作麻煩，不適于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。76連續(xù)式攪拌罐又稱為連續(xù)攪拌釜式反應(yīng)器。77

指的是向反應(yīng)器投入固化酶和底物溶液，不斷攪拌，反應(yīng)達(dá)到平衡之后，再以恒定的流速補(bǔ)充新鮮底物溶液，以相同流速輸出反應(yīng)液。不需要將固定化酶濾出，操作簡(jiǎn)便。但是反應(yīng)效率低，攪拌動(dòng)力消耗大。為了提高反應(yīng)效率，可以把幾個(gè)攪拌罐串聯(lián)起來組成串聯(lián)酶反應(yīng)器。78固定床反應(yīng)器又稱填充床反應(yīng)器79將固定化酶填充于反應(yīng)器內(nèi)，制成穩(wěn)定的固定床。底物溶注以一定的方向和流速不斷地流進(jìn)固定床，產(chǎn)物從固定床出口不斷流出來。優(yōu)點(diǎn)：可使用高濃度的生物催化劑，反應(yīng)效率高；由于產(chǎn)物不斷流出，可減少產(chǎn)物對(duì)酶的抑制；結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，容易操作。缺點(diǎn)：傳質(zhì)系數(shù)和傳熱系數(shù)較低；床內(nèi)壓力大，底物溶液必須加壓才能流入柱內(nèi)；床內(nèi)有自壓縮傾向；更換固定化酶較麻煩。80流化床反應(yīng)器與連續(xù)流攪拌桶式反應(yīng)器類似，是讓適量的顆粒狀酶懸浮于反應(yīng)床中，不用攪拌器，而是底物向上流過固定酶床，因此流速要適當(dāng)控制。81膜型反應(yīng)器由膜狀或板狀的固定化酶所組裝的反應(yīng)器。螺旋卷膜式反應(yīng)器：將含酶的膜片與支持材料交替地纏繞在中心棒上。中空纖維膜式反應(yīng)器：內(nèi)層是緊密光滑的半透性膜，有一定的分子量截留值，其外層是多孔海綿狀的支持層。超濾膜酶反應(yīng)器：又稱為攪拌罐-超濾組合反應(yīng)器。在連續(xù)攪拌罐的出口處，設(shè)置一個(gè)超濾器。82第二代酶反應(yīng)器酶反應(yīng)器有下列技術(shù)問題需要解決：需要輔因子參與的反應(yīng)，如何使輔因子再生受產(chǎn)物抑制的酶反應(yīng)，如何將產(chǎn)物移去，以消除產(chǎn)物抑制作用。底物不溶或微溶于水的酶反應(yīng)，如何使酶反應(yīng)在兩相或多相中進(jìn)行。多酶反應(yīng)如何使幾種酶在反應(yīng)器中催化有序反應(yīng)。83吸附法吸附法分為物理吸附法和離子交換吸附法。物理吸附法:通過氫鍵、疏水作用和π電子親和力等物理作用，將酶固定于水不溶載體上．從而制成固定化酶。常用的載體有：

①有機(jī)載體。纖維素、骨膠原、火棉膠及面筋、淀粉如：木瓜蛋白酶、堿性磷酸脂酶吸附后在載體表面形成單分子層，吸附蛋白能力約70mg/cm2。84②無機(jī)載休。氧化鉛、皂土、白土、高嶺土、多孔玻璃、二氧化鈦等。如：用多孔硅為載體吸附米曲霉和枯草桿菌的淀粉酶以及黑曲霉的糖化酶，在45℃進(jìn)行固定化，用高濃度的底物進(jìn)行連續(xù)反應(yīng)．半衰期分別為14、35、60d。無機(jī)載體的吸附容量較低、而且酶容易脫落。

85(2)離子交換吸附法:

將酶與含有離子交換基的水不溶載體相結(jié)合而達(dá)到固定化的一種方法。酶吸附較牢，在工業(yè)上頗具廣泛的用途。常用的載體有陰離子交換劑，如二乙基氨基乙基(DEAE)-纖維素、DEAE—葡聚糖凝膠；陽(yáng)離子交換劑，如羧甲基(CM)—纖維素、纖維素檸檬酸鹽等。

86優(yōu)點(diǎn)：

吸附法制備固定化酶操作簡(jiǎn)單，可充分選擇不同電荷、不同形狀的載體，吸附過程可以同時(shí)純化酶固定化酶在使用過程失活后可重新活化，同時(shí)，載體可以回收再利用。缺點(diǎn)：

吸附法制備的固定化酶易脫落，影響產(chǎn)物純度和酶的操作為穩(wěn)定性。

87包埋法

包埋法是將聚合物的單體與酶溶液混合，再借助于聚合助進(jìn)劑(包括交聯(lián)劑)的作用進(jìn)行聚合，酶被包埋在聚合物中以達(dá)到固定化。包埋法常用凝膠包埋法和微囊化法。優(yōu)點(diǎn):

包埋法操作簡(jiǎn)單，由于酶分子只被包埋，未受到化學(xué)反應(yīng)，可以制得較高活力的固定化酶．對(duì)大多數(shù)酶、粗酶制劑甚至完整的微生物細(xì)胞都是適用的

88缺點(diǎn):

只有小分子底物和產(chǎn)物可以通過凝膠網(wǎng)絡(luò)，而對(duì)大分子底物不適宜。同時(shí)，凝膠網(wǎng)絡(luò)對(duì)物質(zhì)擴(kuò)散的阻力導(dǎo)致固定化酶動(dòng)力學(xué)行為的變化、活力降低。

89凝膠包埋法:

凝膠包埋法是將酶分子包埋在凝膠格子中。①聚丙烯酰胺凝膠包埋法

聚丙烯酰胺包埋法的缺點(diǎn)是酶容易漏失，以低分子量蛋白質(zhì)為甚，如果調(diào)整交聯(lián)劑濃度與交聯(lián)程度可以得到克服。90②輻射包埋法。

酶溶于純單體水溶液、單體加合物水溶液或純聚合物溶液中．在常溫或低溫下，用x—射線、Y—射線或電子束輻照?？傻玫桨衩傅挠H水凝膠。如用X—射線引發(fā)聚丙烯酰胺聚合，可以固定胰蛋白酶?？梢允褂貌ＡЩ瘑误w，玻璃化單體和非玻璃化單體混合物、單體和天然聚合物的混合物為載體。

91③其他凝膠包埋法。

a.淀粉凝膠包埋法。b.膠原包埋法即大分子絡(luò)合法。

其制備方法極為簡(jiǎn)單：將酶加到膠原懸浮液中、鋪膜、干燥即得固定化酶?；蛘呓?jīng)過透析的酶和膠原混合，插入電極，酶—膠原復(fù)合物便在電極上沉淀。

92(2)微囊化法:將酶包埋于具有半透性聚合物膜的微囊內(nèi)。它使酶存在于類似細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境中，可以防止酶的脫落，防止微囊外環(huán)境直接接觸．從而增加了酶的穩(wěn)定性．同時(shí)，小分子底物能通過膜與酶作用，產(chǎn)物經(jīng)擴(kuò)散而輸出。微囊一般直徑約1～100um，膜厚約100nm，膜上孔徑約3.6nm，表面積與體積之比極大，能有效的包埋許多種酶。微膠囊的制備方法有4種。

93①界面聚合法。

將疏水和親水單體用一種與水不混溶的有機(jī)溶劑作成乳化劑.再將溶于同一個(gè)有機(jī)溶劑的疏水單體溶液,在攪拌下,加入上述乳化液中,在乳化液中的水相和有機(jī)溶劑相互之間的界面發(fā)生聚合化,水相中的酶即被包埋于聚合膜內(nèi).此法曾用來制備脲酶等。

94②液體干燥法。此法曾用乙基纖維素和聚苯乙烯包埋過氧化氫酶、脂肪酶等。它是將一種聚合物溶于一種沸點(diǎn)比水低，且與水不混溶的溶劑中．加入酶液后，加入油溶性表面活性劑為乳化劑使之乳化。再把它分散于含有保護(hù)性膠質(zhì)如明膠、聚丙烯醇和表面活性劑的水溶液中，第二次乳化.在不斷攪拌下，低溫真空除去有機(jī)溶劑，便得含酶微囊。常用聚合體有乙基纖維素、聚苯乙烯、氯橡皮等，有機(jī)溶劑有苯、環(huán)己烷和氯仿。95③脂質(zhì)休包埋法。

采用雙層脂質(zhì)體形成極細(xì)球粒包埋酶。例如．將卵磷脂、膽甾醇和二鯨臘磷酯按7：2：1溶于氯仿中．再加入酶液，混合物在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，在氮?dú)庀?2℃轉(zhuǎn)動(dòng)乳化，然后在室溫下保持2h，再在氮?dú)鈿饬髦校?℃用音波處理10s，在室溫下保持2h，過Sepharose6B柱，收集脂質(zhì)體，離心分離脂質(zhì)體，所得球粒懸浮于緩沖液中，繼續(xù)音波處理，并過Sepharose6B柱，可得含酶的微囊。96共價(jià)鍵結(jié)合法

共價(jià)鍵結(jié)合法是酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)和載休表面上的功能基團(tuán)之間形成共價(jià)鍵而固定的方法。其優(yōu)點(diǎn)是：酶與載體結(jié)合牢固，酶不易脫落，但反應(yīng)條件較激烈，酶易失活，同時(shí)，制作手續(xù)亦較繁瑣。（1）酶分子和載體連接的功能基團(tuán)氨基、羧基、酚基、巰基……972)載體的選擇

載體直接關(guān)系到固定化酶的性質(zhì)和形成。對(duì)載體的一般要求是:①一般親水載體在蛋白質(zhì)結(jié)合量和固定化酶活力及其穩(wěn)定性上都優(yōu)于疏水載體。

②載體結(jié)構(gòu)疏松，表面積大，有一定的機(jī)械強(qiáng)度。

③載體必須有在溫和條件與酶共價(jià)結(jié)合的功能基團(tuán)。

④載休沒有或很少有非專一性吸附。

⑤載體來源容易，方便，并能反復(fù)使用。98(3)偶聯(lián)反應(yīng)

酶和載體的連接反應(yīng)取決于載體上的功能基團(tuán)和酶分子上的非必需側(cè)鏈基團(tuán)，而且是在十分溫和的pH、中等離子強(qiáng)度和較低溫的緩沖液中進(jìn)行。

重氮法：是將帶芳香族氨基的載體，先用NaNO2和稀鹽酸酸處理成重氮鹽衍生物，再在中性偏堿(pH8—9)條件下與酶蛋白發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，得到固定化酶。99

交聯(lián)法交聯(lián)酶法:

在一定條件下，加入一定量的戊二醛溶液于酶溶液中，生成不溶性固定化酶。

如:木瓜蛋白酶和戊二醛在pH6.0、0℃長(zhǎng)時(shí)間反應(yīng)，只得可溶性固定化酶，若在室溫下0一5h，即可形成不溶性固定化酶。這種情況對(duì)不同酶可能有不同結(jié)果。

100酶與輔助蛋白交聯(lián)法:

用雙功能或多功能試劑使惰性蛋白與酶共交聯(lián)．從而制備固定化酶.輔助蛋白，如牛血清白蛋白、明膠、膠原、抗體等，與酶一起進(jìn)行交聯(lián)。例如：10mg脲酶與2.5ml含6％白蛋自、0.2％戊二醛的0.02mol/LpH．8磷酸緩沖液混合，冷到—30后，冉升溫至4下,放置4h將形成的泡沫聚合物徹底洗除后，凍干，即為固定化脲酶。

101載體交聯(lián)法

是用多或雙功能試劑的一部分功能基團(tuán)與載體交聯(lián)，另一部分功能基團(tuán)與酶蛋白交聯(lián)而制備固定化酶的方法。單用戊二醛等試劑交聯(lián)制備的固定化酶活力較低，常將此法與吸附法、包埋法結(jié)合使用，可以達(dá)到既提高固定化酶的活力，又起到加固的效果。

102103固定化酶的性質(zhì)固定化酶活力：與其溶液酶相比，大多數(shù)固定化酶活性下降。固定化酶活力下降的原因主要有：酶與不溶性載體相結(jié)合引起結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化；酶活性中心的重要氨基酸殘基與裁體相結(jié)合。104酶固定化效果的測(cè)定

固定化酶活力：每毫克干重固定化酶每分鐘轉(zhuǎn)化1umol底物量或形成1umol產(chǎn)物的酶量為一個(gè)單位(umol/mg·min)，對(duì)于酶管、酶膜、酶板等，則以單位面積（cm2）的初速度來表示。偶聯(lián)效率偶聯(lián)效率以載體結(jié)合酶量(或酶活力)的百分?jǐn)?shù)表示：

105活力回收和相對(duì)活力酶固定化—般比溶液酶的活力下降，固定化酶活力占溶液酶活力的百分?jǐn)?shù)稱為活力回收。

106固定化酶的穩(wěn)定性

大多數(shù)酶在固定化后都不同程度地提高了穩(wěn)定性．延長(zhǎng)了有效壽命。這是由于：第一，固定化增加了酶構(gòu)象的牢固程度。第二，擋住了不利因素對(duì)酶的侵襲。第三，限制了酶分子間的相互作用。107熱穩(wěn)定性

大多數(shù)酶在固定化后與溶液酶相比，有較高的熱穩(wěn)定性如氨基酰化酶。溶液酶在75℃保溫15min，活力為0；DEAE—Sephadex固定化酶在同樣條件下仍有80％；DEAE—纖維素固定化酶在同樣條件下還有60％活力。這種性質(zhì)對(duì)工業(yè)上的應(yīng)用是有益的。固定化酶反應(yīng)的溫度一般較溶液酶的高如用CM—纖維素固定的胰蛋白酶和糜蛋白酶的最適溫度比溶液酶高5—15℃。

108pH一酶活力關(guān)系反應(yīng)的最適pH和酶活力—pH曲線的變動(dòng)依據(jù)酶蛋白和載體的電荷而定。帶負(fù)電荷的載體，往往導(dǎo)致固定化酶的最適pH向堿性方向移動(dòng)；帶正電荷的載體則相反。例如：DEAE—纖維素固定化氨基酰化酶與其游離酶比較，低0.5個(gè)pH而偏向酸性方向。CM一纖維素固定化的胰蛋白酶、糜蛋白酶的最適pH與游離酶比較，向堿性方向偏移0.5—1個(gè)pH單位。

109對(duì)蛋白酶的抵抗力提高

溶液酶經(jīng)固定化后提高了對(duì)蛋白酶的抵抗能力。比如：氨基?；冈谝鹊鞍酌缸饔孟禄盍H存20％，而將其固定于DEAE—纖維素上在同樣條件下仍有80％的活力。這可能是因?yàn)榈鞍酌阜肿恿看?，受到空間位阻，不能進(jìn)入固定化酶中.

110對(duì)變性劑、抑制劑的抵抗能力提高

酶經(jīng)固定化后，提高了對(duì)蛋白質(zhì)變