不同萃取頭對水稻揮發(fā)物的萃取效果比較

不同萃取頭對水稻揮發(fā)物的萃取效果比較

0植物揮發(fā)物的分布【研究意義】植物昆蟲的損害不僅誘導(dǎo)植物合成有毒的抗蟲劑，還誘導(dǎo)植物釋放釋放的有機化合物，直接驅(qū)蚊，吸引昆蟲天敵。害蟲誘導(dǎo)受害植物產(chǎn)生的揮發(fā)物還可以誘導(dǎo)鄰近健康植物產(chǎn)生抗蟲性。蟲害誘導(dǎo)的植物揮發(fā)物在植物與植物、植物與微生物及植物-昆蟲間的信息傳遞中扮演了重要的角色。水稻受草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)、褐飛虱(Nilaparvatalugens)及斜紋夜蛾(Spodopteralitura)危害后,都會釋放出不同種類和數(shù)量的揮發(fā)物。水稻受斜紋夜蛾侵害后,產(chǎn)生的揮發(fā)物對褐飛虱有明顯拒避作用。植物揮發(fā)物的釋放量極低,又受很多因素的影響,所以變異性很大。選擇合適的方法,高效、準確地收集植物揮發(fā)物,滿足檢測要求,對植物揮發(fā)物的研究具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前,植物揮發(fā)物收集主要是動態(tài)頂空收集法(DHS)和固相微萃取法(solidphasemicroextraction,SPME)。Fujii等用SPME法萃取了不同生長階段的水稻釋放的揮發(fā)物;Cheng等也用該法收集研究了水稻的誘導(dǎo)揮發(fā)物,特別是研究了β-石竹烯的變化;Yuan等和Zhao等應(yīng)用DHS法研究了水稻蟲害誘導(dǎo)的揮發(fā)物?！颈狙芯壳腥朦c】由于SPME技術(shù)具有簡單、快速、可與GC或GC-MS聯(lián)用等諸多優(yōu)點,逐漸得到廣泛的應(yīng)用。研究者雖然用不同的萃取頭研究了水稻等很多植物的揮發(fā)物,但這些萃取頭萃取到的水稻揮發(fā)物有什么差異,與DHS法相比又有什么異同和優(yōu)缺點尚不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究擬采用茉莉酸甲酯(MEJA)處理水稻,用不同膜厚、極性的SPME纖維頭對水稻的誘導(dǎo)揮發(fā)物進行研究,并與DHS法收集的揮發(fā)物進行比較,為選擇合適的水稻等植物揮發(fā)物的收集方法提供參考依據(jù)。1農(nóng)業(yè)生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境協(xié)同實驗室建設(shè)試驗于2010年7月至2011年4月在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)部生態(tài)農(nóng)業(yè)重點開放實驗室及廣東省高等學(xué)校農(nóng)業(yè)生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境重點實驗室完成。1.1發(fā)揮水稻的作用水稻(石守白毛,OryzasativaL.)種子常溫萌發(fā)后,移至直徑9cm、高15cm的塑料杯中,于(25±3)℃培養(yǎng)3周,將水稻小心取出,洗凈根部泥土,移至裝有100mL250μmolMEJA溶液的塑料杯中,24h后用于揮發(fā)物收集。對照用100mL蒸餾水以同樣方法處理水稻苗。1.2頭發(fā)收集1.2.1spme法將水稻苗剪去根部,地上部分放入20mL的頂空瓶中,密封后插入萃取頭,于25℃培養(yǎng)箱中萃取40min。1.2.2采樣袋-porapac將水稻地上部分用2L聚四氟乙烯氣體采樣袋套住,靠近根部的位置用特制密封條盡量密封。來自鋼瓶的純凈空氣以700mL·min-1的流量進入采樣袋,用氣體采樣泵以500mL·min-1的流量經(jīng)PorapakQ(50mg,100—120目。預(yù)先用二氯甲烷清洗并用氮氣吹干)吸附管排出。收集5h(9:00—14:00)。1.3表面分析1.3.1gcms-qp氣相色譜儀(Agilent6890N),氣-質(zhì)聯(lián)用儀(ShimadzuGCMS-QP2010)。固相微萃取儀及三種萃取纖維頭(100μm聚二甲基硅氧烷(PDMS)、7μmPDMS和85μm聚丙烯酸酯(PA))(Supelco公司)。1.3.2試劑二氯甲烷為色譜純。PorapakQ吸附劑購自北京海淀潮聲技術(shù)開發(fā)公司,標準品購自Sigma公司。1.3.3譜柱及升溫程序(1)樣品處理:SPME法萃取后直接進樣。DHS法的吸附管用200μL二氯甲烷洗脫至進樣瓶中,取2μL上機測定。(2)色譜分析條件:色譜柱為DB-5MS(30m×0.25mm×0.25μm),氣相色譜進樣口220℃,不分流模式。升溫程序:40℃保持3min,然后以5℃/min升至200℃,再以30℃/min升至250℃,保持4min。FID檢測器:280℃。氣-質(zhì)聯(lián)用儀為EI源,電離能70eV。各成分通過核對譜庫(NIST)的質(zhì)譜圖或與標準化合物的保留時間對比,并根據(jù)文獻報道的植物揮發(fā)物的保留時間對揮發(fā)物的各組分進行鑒定。2結(jié)果2.1不同峰面積pdms萃取能力3種萃取頭對水稻誘導(dǎo)揮發(fā)物的萃取能力不同,獲得的色譜圖有較大差異(圖1,a、b、c)。萃取的揮發(fā)物種類和數(shù)量都不同,表現(xiàn)出比較強的選擇性。其中100μmPDMS萃取頭萃取能力(以總峰面積響應(yīng)值表示)最強,總峰面積為(445.21±64.45),其次是85μmPA(279.11±30.79),萃取能力最弱的是7μmPDMS萃取頭(92.39±9.95)。從表可以看出,在相同試驗條件下,100μmPDMS萃取的揮發(fā)物有28種,PA有23種,7μmPDMS有19種。85μmPA、100μmPDMS和7μmPDMS萃取的揮發(fā)物中相對峰面積最大的依次是芳樟醇、β-石竹烯以及一種分子量較高的未知萜烯類化合物。3種萃取頭得出的揮發(fā)物組分基本在20min之后出峰,在本試驗條件下,對低沸點組分的萃取效果較差。2.2dhs法與spme法DHS法與SPME法(100μmPDMS)收集的揮發(fā)物的組分數(shù)相同(圖1,a和d)。在表所列的揮發(fā)物中,DHS法和SPME法都能收集約80%的組分,且揮發(fā)物的組成類別相似(圖2)。DHS法與SPME法都以萜烯類為主,前者單萜稍多一些,后者倍半萜稍多。萃取能力最強的組分都是β-石竹烯,但2種方法獲得的揮發(fā)物組分有所不同,如在本試驗條件下,DHS法可以捕集到少量綠葉性氣體(表),而SPME法未見此類物質(zhì)峰。同樣,SPME法可以捕集到的一些物質(zhì),如水楊酸甲酯等,在DHS法中則未發(fā)現(xiàn)。3spme法與其他萃取方法的比較植物揮發(fā)物與很多因素有關(guān),揮發(fā)物的組成和含量除了與害蟲種類有關(guān)外,還受水稻品種、生長時期、環(huán)境條件、收集手段、檢測方法等多種因素的影響,其中不同的收集手段和方式對不同揮發(fā)物的捕集效率不同,因而對檢測結(jié)果影響較大。SPME法對不同的植物揮發(fā)物的萃取能力與萃取纖維頭的性質(zhì)有關(guān)。萃取纖維的極性和膜厚決定了能夠萃取到的揮發(fā)物的種類和組成比例。一般極性物質(zhì)選用85μmPA膜,非極性物質(zhì)用PDMS膜,所以本試驗中PA膜萃取到的酯類、醇類等極性化合物的比例較高,而PDMS萃取到的萜烯類物質(zhì)較多。7μmPDMS用于大分子量的揮發(fā)物分析,100μmPDMS主要用于小分子量的揮發(fā)物分析。從本試驗結(jié)果看,水稻的揮發(fā)物中大分子量的揮發(fā)物并不多。目前的研究大多數(shù)選擇100μmPDMS萃取水稻揮發(fā)物或其它植物的揮發(fā)物,也有的選擇PDMS與DVB(二乙烯苯)結(jié)合或PDMS與CAR(分子篩)結(jié)合的萃取頭。這種2種或3種不同極性相結(jié)合的萃取頭具有更強的吸附能力,在植物揮發(fā)物的研究中應(yīng)根據(jù)目標組分的性質(zhì)選擇萃取頭。SPME法在收集和測定過程中還要嚴格控制試驗條件,尤其要注意植物樣品的選擇,否則定量分析會產(chǎn)生較大的變異,某些含量低的組分也易流失。用SPME法做定量分析,還需要注意纖維插入的深度、頂空體積、萃取時間以及環(huán)境溫度要保持一致。SPME法與DHS法萃取的化合物種類基本相同,每種方法中某些組分的缺失可能與植物的生育期有關(guān),也可能與試驗方法有關(guān)。如本試驗中,與DHS法不同,SPME法采集的是剪去根部的水稻地上部的揮發(fā)物。SPME法也有檢測到綠葉性氣體的報道,DHS法也可以檢測到水楊酸甲酯。增加萃取時間、增加樣品的生物量以及選擇合適的采樣時段,都是解決揮發(fā)物組分缺失或靈敏度太低的手段。此外,也可以采取磨碎樣品并適當加熱的方法以促進植物內(nèi)部累積的揮發(fā)物充分釋放并縮短萃取時間,這種方法還有利于控制試驗條件的一致性。磨碎后的樣品與完整的樣品產(chǎn)生的揮發(fā)物基本相似,只是用量更少。究竟選擇哪一種萃取方法,還是要根據(jù)試驗條件和試驗結(jié)果的比較來確定。由于SPME法是將一次萃取的結(jié)果全部用于進樣分析,而DHS法只是分取2μL進樣,所以前者觀察到的峰較明顯。同時因收集時間不同,二者在萃取揮發(fā)物的總量上不具可比性。簡單快速的SPME法與裝置復(fù)雜、耗時長的DHS法相比具有明顯的優(yōu)點,但樣品只能一次性進樣,無法保存。而DHS法獲得的樣品可以多次上機測定,并能在低溫冰箱保存。SPME法在植物揮發(fā)物測定中的應(yīng)用還面臨著許多問題和挑戰(zhàn),需要在今后的工作中進一步研究