高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定人血漿中氯吡格雷

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定人血漿中氯吡格雷

氯吡咯（cl）是一種抗血小板聚集劑，為新的酪氨酸酶反應(yīng)。主要適用于有過(guò)近期發(fā)作的中風(fēng)、心肌梗死和確診外周動(dòng)脈疾患者。臨床上用來(lái)預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化患者發(fā)生心肌梗死和缺血性腦卒中,且與阿司匹林合用可以治療急性冠狀動(dòng)脈綜合癥,常見(jiàn)的不良反應(yīng)為血液系統(tǒng)不良反應(yīng),臨床應(yīng)用時(shí)要定期監(jiān)測(cè)血常規(guī)和凝血機(jī)制。國(guó)內(nèi)近年來(lái)尚無(wú)測(cè)定氯吡格雷的相關(guān)報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)以高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS/MS)測(cè)定人血漿中氯吡格雷含量,為氯吡格雷制劑的藥動(dòng)學(xué)研究及臨床用藥患者血藥濃度監(jiān)測(cè)提供參考。1gc/ms色譜有限公司ThermoFiniganTSQQuantumDiscoveryMax型液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(含HPLC配備四元高壓泵,在線真空脫氣機(jī),自動(dòng)進(jìn)樣器及其溫控系統(tǒng),ESI質(zhì)譜檢測(cè)器);色譜工作站:Xcalibur高級(jí)色譜工作站;硫酸氫氯吡格雷對(duì)照品(北京諾德恒信化工技術(shù)有限公司,批號(hào)NDS0060513,含量99.55%);內(nèi)標(biāo)那格列奈標(biāo)準(zhǔn)品(江蘇德源藥業(yè)有限公司,含量99.8%);甲醇為色譜醇;其他試劑均為分析純。2方法和結(jié)果2.1血漿中峰峰干擾測(cè)定色譜柱:TeknokromaC18(100mm×2.1mm,5μm);流動(dòng)相:甲醇-0.1%甲酸水(80∶20);流速:0.2mL·min-1;柱溫:35℃。質(zhì)譜條件:離子檢測(cè)方式:選擇性離子檢測(cè)(SRM);離子極性:正離子;離子化方式:氣動(dòng)輔助電噴霧離子化(ESI);檢測(cè)對(duì)象:氯吡格雷[M+H]+,m/z322.1/212.1;內(nèi)標(biāo):那格列奈[M+H]+,318.3/166.2;噴霧電壓:4000V;鞘氣壓力:15psi;輔助氣壓力:5psi;毛細(xì)管溫度:320℃;管透鏡電壓:112V;碰撞氣壓力:1.5mtorr;碰撞能量:10V;進(jìn)樣量:10μL。色譜圖見(jiàn)圖1。由圖可見(jiàn),血漿中無(wú)雜峰干擾測(cè)定,峰形良好,基線平穩(wěn)。氯吡格雷和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別約為4.4,3.7min。2.2含氯吡雷溶液的配制精密稱取硫酸氫氯吡格雷6.54mg于50mL量瓶中,甲醇溶解并定容至刻度(得到含氯吡格雷100mg·L-1的溶液)。進(jìn)一步稀釋得到50,5,0.5μg·L-1的氯吡格雷甲醇溶液。2.3內(nèi)標(biāo)溶液的制備精密稱取那格列奈5mg于10mL量瓶中,甲醇溶解并定容至刻度,進(jìn)一步稀釋得到1mg·L-1的甲醇溶液。2.4提取提取劑為5.2精密移取血漿樣品0.5mL于離心管中,精密加入那格列奈內(nèi)標(biāo)液10μL(質(zhì)量濃度1mg·L-1),漩渦混合30s;加入有機(jī)溶劑4mL(乙醚-正己烷,4∶1)提取液4mL,渦旋3min,離心(3500r·min-1)10min。吸取上層有機(jī)相于另一離心管中,40℃水浴氮?dú)獯蹈?殘?jiān)?00μL流動(dòng)相溶解,取10μL進(jìn)樣分析。以氯吡格雷與內(nèi)標(biāo)峰面積之比代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算氯吡格雷的血藥濃度。2.5血藥濃度線性回歸分析取離心管數(shù)支,分別精密加入不同量的氯吡格雷對(duì)照品溶液,用氮?dú)饬鞔蹈珊蠹尤虢】等搜獫{0.5mL,渦旋30s,使血漿中氯吡格雷的質(zhì)量濃度分別為5,20,80,300,800,2000,5000ng·L-1,每種濃度5份。按“2.4”方法操作,以氯吡格雷和內(nèi)標(biāo)峰面積之比的均值(A)對(duì)血藥濃度(C,ng·L-1)進(jìn)行線性回歸。在5～5000ng·L-1的范圍內(nèi),氯吡格雷與內(nèi)標(biāo)的峰面積比與濃度呈良好的線性關(guān)系,回歸方程:A=0.0161C+0.0825,r=0.9927,權(quán)重系數(shù)為1/C2,定量下限為5ng·L-1。2.6返回率測(cè)試2.6.1以“5.4”項(xiàng)為運(yùn)作條件的試驗(yàn)取健康人血漿0.5mL若干,精密加入氯吡格雷對(duì)照溶液,使其含氯吡格雷分別為20,300,2000ng·L-1,再按“2.4”項(xiàng)下的方法操作后進(jìn)樣分析。記錄氯吡格雷與內(nèi)標(biāo)的峰面積比f(wàn)i代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程中,計(jì)算氯吡格雷血藥濃度,以測(cè)得值與加入值之比計(jì)算方法回收率。2.6.2漸進(jìn)樣分析取空白血漿0.5mL若干,同時(shí)精密加入氯吡格雷對(duì)照溶液,使其含氯吡格雷分別為20,300,2000ng·L-1,再按“2.4”項(xiàng)下的方法操作后進(jìn)樣分析。另取一定量的氯吡格雷對(duì)照溶液,用流動(dòng)相稀釋后,與血樣中含量相等的氯吡格雷比較,記錄峰面積計(jì)算提取回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。方法回收率在90%以上,確保了定量的準(zhǔn)確性和可靠性。2.7血樣的日密度和持續(xù)時(shí)間配制低、中、高3個(gè)濃度點(diǎn)(分別含氯吡格雷20,300,2000ng·L-1)的標(biāo)準(zhǔn)血樣各5份,于同一日按“2.4”項(xiàng)的方法操作后進(jìn)樣分析,計(jì)算日內(nèi)精密度。連續(xù)5d按此法操作,綜合5d數(shù)據(jù),計(jì)算日間精密度。結(jié)果見(jiàn)表2。氯吡格雷的日內(nèi)、日間精密度RSD均小于10%,方法的精密度良好。2.8反復(fù)凍融穩(wěn)定性試驗(yàn)用空白血漿配制分別含氯吡格雷20,300,2000ng·L-1的標(biāo)準(zhǔn)血樣,分別進(jìn)行室溫放置、冷凍保存、反復(fù)凍融穩(wěn)定性試驗(yàn)。結(jié)果表明樣品在室溫放置、進(jìn)樣器中(4℃)放置10h、冰箱中(-20℃)冷凍保存3周、反復(fù)凍融3次條件下樣品穩(wěn)定性良好。2.9兩種血樣的分離急性冠脈綜合征(ACS)的入院患者,經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(PCI)給予氯吡格雷75mg(SanofiWinthropindustrie生產(chǎn),杭州賽諾菲安萬(wàn)特民生制藥有限公司分裝,規(guī)格75mg,分裝批號(hào)0801021),給藥后2,4h定時(shí)采取血樣3mL于肝素化試管中,分離出血漿,-20℃冰箱保存待測(cè)。氯吡格雷給藥后2h質(zhì)量濃度為(500.4±102.3)ng·L-1,4h質(zhì)量濃度為(200.7±68.2)ng·L-1。結(jié)果表明,該方法可以用于臨床患者監(jiān)測(cè)血漿中氯吡格雷的濃度。3內(nèi)標(biāo)和外標(biāo)的選擇氯吡格雷目前已被廣泛應(yīng)用于冠脈支架植入術(shù)中術(shù)后預(yù)防急慢性血栓形成。其活性代謝物為氯吡格雷氧化水解而成的一種硫醇衍生物,該化合物極不穩(wěn)定,血漿中檢測(cè)不到。氯吡格雷循環(huán)血中濃度很低(Cmax<8000ng·L-1),其定量需要高靈敏度的生物分析方法。氯吡格雷血樣測(cè)定文獻(xiàn)報(bào)道均為HPLC-MS/MS,血漿中藥物的提取分別采用加入pH6.8的醋酸銨緩沖液后采用乙醚提取和直接用有機(jī)提取液(乙醚-正己烷)提取,最低定量限分別為5,10ng·L-1;本實(shí)驗(yàn)采用[乙醚-正己烷(4∶1)]有機(jī)溶劑提取法,定量下限做到5ng·