高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定人血漿中氯沙坦氫氯噻嗪

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定人血漿中氯沙坦氫氯噻嗪

氯磺酸-氫氯仿銨是第一個(gè)血管緊張素（ang）的受體阻滯劑和尿劑的聯(lián)合制劑。氯沙坦和氫氯噻嗪的降壓作用疊加,二者合用時(shí),能削弱氫氯噻嗪因刺激腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)而產(chǎn)生的對(duì)抗血壓調(diào)節(jié)的作用,AngⅡ受體選擇性地被阻斷的同時(shí),利尿劑的降壓作用可得到增強(qiáng),且副作用降低。所以氯沙坦鉀/氫氯噻嗪復(fù)方制劑在臨床上適用于聯(lián)合用藥的高血壓患者,以及重度高血壓患者的初期治療。本實(shí)驗(yàn)用HPLC-MS/MS法對(duì)氯沙坦鉀和氫氯噻嗪進(jìn)行分別測(cè)定,對(duì)20名健康男性志愿者口服氯沙坦鉀氫氯噻嗪參比和受試制劑后的藥物動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究,以便為臨床用藥提供參考。材料、對(duì)象和方法1氯沙坦鉀和氫氯噻嗪的對(duì)照品受試制劑:氯沙坦鉀氫氯噻嗪片,規(guī)格:每片含氯沙坦鉀50mg、氫氯噻嗪每片12.5mg,批號(hào):050506,北京雙吉制藥有限公司生產(chǎn);參比制劑:氯沙坦鉀氫氯噻嗪片(商品名:海捷亞),規(guī)格:每片含氯沙坦鉀50mg、氫氯噻嗪每片12.5mg,批號(hào):S1170,MerckSharp&DohmeLtd.(UK)生產(chǎn);氯沙坦鉀和氫氯噻嗪的對(duì)照品(99.8%);內(nèi)標(biāo):布洛芬對(duì)照品,含量:99.6%,均由北京雙吉制藥有限公司提供;替米沙坦對(duì)照品,含量:99.6%,北京萬(wàn)生藥業(yè)有限公司提供。甲醇、乙腈、甲酸、氨水、乙醚,色譜純,均為迪馬公司提供;水為雙重蒸餾水;空白血漿,沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院提供。1100液相系統(tǒng),包括G1311A四元輸液泵、G1313A自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱和G1379A脫氣機(jī),美國(guó)安捷倫公司產(chǎn)品;API2000三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀,配備電噴霧離子源、Analyst1.4.1軟件,均為美國(guó)AppliedBiosystems公司產(chǎn)品;BS124SSartorius電子天平,北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品;TGL-16G離心沉淀機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品;XW-80渦旋混合器,上海手術(shù)器械廠產(chǎn)品。DAS1.0統(tǒng)計(jì)計(jì)算軟件,中國(guó)藥理學(xué)會(huì)。2試驗(yàn)前后的體質(zhì)量選擇健康男性志愿受試者20名,年齡為21～25歲,身高156～180cm,體質(zhì)量在標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量的±10%內(nèi)。無(wú)繼往病史和藥物過(guò)敏史,精神狀態(tài)良好,平時(shí)很少服藥,不吸煙,不嗜酒,試驗(yàn)前2周內(nèi)未服用任何藥物。試驗(yàn)前后,接受全面體檢(包括血常規(guī)、肝、腎功能及心電圖檢查),結(jié)果均屬正常。受試者于試驗(yàn)前簽署知情同意書(shū)。3飲食、飲食試驗(yàn)試驗(yàn)方案由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。隔夜禁食12h后,于次日早晨空腹單次口服氯沙坦鉀氫氯噻嗪片(氯沙坦鉀50mg、氫氯噻嗪每片12.5mg),用溫開(kāi)水200mL吞服。試驗(yàn)期間統(tǒng)一飲食;試驗(yàn)期間,禁止抽煙喝酒和劇烈運(yùn)動(dòng),并不得使用其他任何藥物及大蒜蔥等有抑菌作用的食品;服藥后2h,進(jìn)食統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)餐。分別于服藥前及服藥后0.33、0.67、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、10、12、24、36h,由肘正中靜脈取血5mL,并立即移入經(jīng)肝素處理的離心試管中,3500r·min-1離心10min,分離血漿,于-20℃冰箱保存待測(cè)。4鉻和鉻的形成4.1水質(zhì)條件:3.2色譜柱:ZobaxXDB-C18色譜柱(150mm×4.6mm,5μm);流動(dòng)相為甲醇-1%甲酸(80∶20);流量:0.5mL·min-1;柱溫25℃;進(jìn)樣:10μL。質(zhì)譜條件:離子源為電噴霧電離源(TurboIonspray);正離子方式檢測(cè);掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM),碰撞能量(CE)分別為30eV(氯沙坦)和50eV(替米沙坦);用于定量分析的離子反應(yīng)分別為m/z423→m/z207(氯沙坦)和m/z515→m/z276(替米沙坦),掃描時(shí)間為0.2s。4.2質(zhì)譜條件色譜柱:ZobaxXDB-C18色譜柱(150mm×4.6mm,5μm);流動(dòng)相為乙腈-2%氨水(80∶20);流量0.5mL·min-1;柱溫25℃;進(jìn)樣:10μL。質(zhì)譜條件:離子源為電噴霧電離源(TurboIonspray);負(fù)離子方式檢測(cè);掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM),碰撞能量(CE)分別為-28eV(氫氯噻嗪)和-10eV(布洛芬);用于定量分析的離子反應(yīng)分別為m/z296.0→m/z204.9(氫氯噻嗪)和m/z205.1→m/z161.0(布洛芬),掃描時(shí)間為0.2s。5lc/ms分析氯沙坦取血漿200μL,分別加入甲醇50μL,內(nèi)標(biāo)溶液50μL(200ng·mL-1替米沙坦溶液)和1%甲酸50μL,混勻;加乙醚6mL,渦流混合1min,10000r·min-1離心5min;取上清液于另一試管中,40℃氮?dú)饬飨麓蹈?殘留物加入流動(dòng)相100μL溶解,渦流混合,取10μL進(jìn)行LC/MS/MS分析。氫氯噻嗪取血漿200μL,分別加入流動(dòng)相50μL,內(nèi)標(biāo)溶液50μL(100ng·mL-1布洛芬溶液),渦流混合1min;加乙醚5mL,渦流混合2min,10000r·min-1離心5min;分取上層有機(jī)相于另一試管中,于40℃氮?dú)饬飨麓蹈?殘留物加入流動(dòng)相100μL溶解,渦流混合,取20μL進(jìn)行LC/MS/MS分析。結(jié)果1方法學(xué)評(píng)價(jià)1.1內(nèi)標(biāo)布洛芬和氯沙坦的保留時(shí)間用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行測(cè)定,本試驗(yàn)條件下,測(cè)得色譜圖見(jiàn)圖1、2。由圖1、2可見(jiàn),血漿中氯沙坦和內(nèi)標(biāo)替米沙坦的保留時(shí)間分別為2.53、2.00min;氫氯噻嗪和內(nèi)標(biāo)布洛芬的保留時(shí)間分別為2.5、2.05min。表明空白血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測(cè)定。1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程氯沙坦取空白血漿200μL,加氯沙坦標(biāo)準(zhǔn)溶液50μL,配制成相當(dāng)于氯沙坦血漿濃度為5、10、20、50、100、200和400ng·mL-1的樣品,按上述方法操作,每一濃度進(jìn)行雙樣本分析,進(jìn)樣10μL;以待測(cè)物濃度為橫坐標(biāo)、待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值為縱坐標(biāo),用加權(quán)(W=1/X2)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算,求得直線回歸方程為Y=1.74×10-2X+1.06×10-2(γ=0.9982);定量下限為5.0ng·mL-1。氫氯噻嗪取空白血漿200μL,加標(biāo)準(zhǔn)系列溶液50μL,配制成相當(dāng)于氫氯噻嗪血漿濃度為1、2、5、10、20、50和100ng·mL-1的樣品,按上述方法操作,每一濃度進(jìn)行雙樣本分析,進(jìn)樣20μL;以待測(cè)物濃度為橫坐標(biāo)、待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值為縱坐標(biāo),用加權(quán)(W=1/X2)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算,求得直線回歸方程為Y=2.72×10-3X+1.14×10-3(γ=0.9988);定量下限為1.0ng·mL-1。1.3準(zhǔn)確度、精密度和回收率取空白血漿,配置氯沙坦低、中、高3個(gè)濃度(10、50和320ng·mL-1)的質(zhì)控樣品和氫氯噻嗪低、中、高3個(gè)濃度(2、20和80ng·mL-1)的質(zhì)控樣品,每一濃度進(jìn)行6樣本分析,連續(xù)測(cè)定3d,根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線,求得準(zhǔn)確度與日內(nèi)、日間精密度,結(jié)果見(jiàn)表1。以提取后的色譜峰面積與空白血漿提取后加入對(duì)照品溶液進(jìn)樣獲得的色譜峰面積之比,考察方法的提取回收率,結(jié)果見(jiàn)表2。內(nèi)標(biāo)物提取回收率試驗(yàn)方法相同,提取回收率均>60%。1.4萃取藥物穩(wěn)定性的測(cè)定取空白血漿,配制氯沙坦和氫氯噻嗪的低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品,每濃度3樣本分析,考察藥物的穩(wěn)定性。結(jié)果表明,氯沙坦血漿樣品經(jīng)液液萃取處理后,室溫放置12h;經(jīng)2次冷凍-解凍循環(huán),-20℃保存15天穩(wěn)定;氫氯噻嗪血漿樣品經(jīng)液液萃取處理后,室溫放置12h,經(jīng)2次冷凍-解凍循環(huán),-20℃保存15天穩(wěn)定。2服藥時(shí)間曲線20名健康受試者口服受試制劑和參比制劑(氯沙坦鉀50mg、氫氯噻嗪12.5mg)后,平均血藥濃度-時(shí)間曲線,見(jiàn)圖3。3藥房動(dòng)態(tài)參數(shù)用梯形法計(jì)算AUC,以半對(duì)數(shù)作圖法由消除相濃度點(diǎn)計(jì)算t1/2;tmax和Cmax用實(shí)測(cè)值,結(jié)果見(jiàn)表3。4生物利用度測(cè)定結(jié)果20名受試者口服含氯沙坦鉀50mg、氫氯噻嗪12.5mg的受試制劑和參比制劑后氯沙坦相對(duì)生物利用度平均為(96.5±21.2)%,方差分析結(jié)果表明,受試制劑與參比制劑相比,生物利用度無(wú)顯著性差異,受試制劑AUC0-t的90%置信區(qū)間為參比制劑相應(yīng)參數(shù)的86.0%～103.2%。氫氯噻嗪的相對(duì)生物利用度平均為(106.8±22.9)%,方差分析結(jié)果表明,受試制劑與參比制劑相比,生物利用度無(wú)顯著性差異,受試制劑AUC0-t的90%置信區(qū)間為參比制劑相應(yīng)參數(shù)的96.3%～113.5%,表明2種制劑具有生物等效性。流動(dòng)相條件存在的靈敏度氯沙坦正離子電離方式下有強(qiáng)吸收;而氫氯噻嗪在正離子電離方式下無(wú)質(zhì)譜響應(yīng)。氫氯噻嗪在負(fù)離子電離方式下有較強(qiáng)的吸收;而氯沙坦在負(fù)離子電離方式下強(qiáng)度很弱,因此選擇分別用2種離子模式對(duì)氯沙坦、氫氯噻嗪進(jìn)行測(cè)定。由于氯沙坦在正離子電離方式下進(jìn)行測(cè)定,因此在流動(dòng)相中加入適量甲酸能明顯提高靈敏度;同樣,氫氯噻嗪在負(fù)離子電離方式下進(jìn)行測(cè)定,在流動(dòng)相中加入適量氨水,使其靈敏度較同樣不加氨水條件下峰型和靈敏度均得到明顯改善,增加了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性。將主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行方差分析,結(jié)果顯示,受試制劑和參比制劑中氯沙坦和氫氯噻