流式細(xì)胞基本原理和在白血病中應(yīng)用

流式細(xì)胞學(xué)在血液病中的臨床應(yīng)用〔根底篇〕1精選ppt流式細(xì)胞術(shù)的根本概念流式細(xì)胞術(shù)是一項集激光技術(shù)、流體力學(xué)技術(shù)、光電測量技術(shù)、計算機技術(shù)以及細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的新型高科技技術(shù)?？焖?、準(zhǔn)確、客觀，多參數(shù)，可同時對特定群體加以分選。研究對象為生物顆粒，如各種細(xì)胞、微生物及人工合成微球等。研究的微粒特性包括多種物理及生物學(xué)特征，并加以定量。

是當(dāng)代最先進的細(xì)胞定量分析技術(shù)

2精選ppt白血病和淋巴瘤的免疫分型微量殘留白血病細(xì)胞檢查陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿多發(fā)性骨髓瘤干細(xì)胞計數(shù)腫瘤細(xì)胞的周期和倍體分析網(wǎng)織紅細(xì)胞和網(wǎng)織血小板計數(shù)免疫狀態(tài)監(jiān)測血小板功能及相關(guān)疾病HLA-B27流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用3精選ppt標(biāo)本來源：外周血、骨髓、組織塊、培養(yǎng)細(xì)胞、脫落細(xì)胞及其他血清或各類體液樣本。肝素抗凝的外周血和骨髓標(biāo)本，存放時限為48～72小時；EDTA抗凝標(biāo)本，存放時限只有12～24小時，因為髓細(xì)胞在此條件下會裂解；4精選ppt直方圖散點圖二維等高圖密度圖常見的幾種流式細(xì)胞圖5精選ppt設(shè)門淋巴細(xì)胞亞群6精選ppt一：白血病免疫分型7精選ppt白血病診斷依賴于多種檢測方法樣本形態(tài)學(xué)流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞遺傳學(xué)/FISH分子生物學(xué)根底和金標(biāo)準(zhǔn)

必需

重要8精選ppt急性白血病免疫分型的價值區(qū)分淋系、髓系白血病區(qū)分淋系白血病中的T、B-ALL鑒定混合細(xì)胞性白血病的類型：

T-M、B-M、T-B、T-B-M治療過程中監(jiān)測MRD，評價療效提示某些遺傳學(xué)異常：CD19+AML---t(8;21)；CD13+CD33+B-ALL---t(9;22)提示預(yù)后：CD56等陽性的AML患者預(yù)后不良CD15陽性的AML患者CR率高

9精選ppt正常造血細(xì)胞各系列抗原表達(dá)的演進不管是在胚胎期、老年期、還是化療以后，正常造血細(xì)胞抗原組合的表達(dá)模式都不改變。10精選ppt白血病細(xì)胞外表抗原異常表達(dá)造血細(xì)胞抗原組合的表達(dá)模型能夠用于鑒別惡性克隆!白血病克隆與正常細(xì)胞之間抗原表達(dá)不同---白血病相關(guān)的免疫表型〔LAIP〕11精選ppt正常造血細(xì)胞白血病細(xì)胞抗原表達(dá)遵循系列保守性出現(xiàn)抗原跨系表達(dá)髓系:CD33+,T系:CD7+髓系:CD33+CD7+抗原表達(dá)有一定的時序性出現(xiàn)抗原時序混亂表達(dá)原始細(xì)胞:CD34+CD15- 原始細(xì)胞:CD34+CD15+各階段細(xì)胞按一定的比例分布出現(xiàn)分化阻滯原幼細(xì)胞<5%原幼細(xì)胞>20%

抗原表達(dá)的缺失抗原強度的異常

12精選ppt需要掌握正常造血細(xì)胞的抗原表達(dá)規(guī)律不同系列的細(xì)胞表達(dá)的抗原？同一系列不同階段的細(xì)胞表達(dá)的抗原？每種抗原的表達(dá)強度？13精選ppt免疫分型常用的抗體干祖細(xì)胞CD34、TDT、CD117、CD38、HLA-DR、AMLCD33、CD13、CD11b、CD15、CD64、CD14、MPO疑心M6加做CD71、GPA疑心M7加做CD61、CD41、CD42B-ALLCD10、CD19、CD20、CD22、c/mIg、cCD22/CD79aT-ALLCD10、CD3、CD4、CD8、CD2、CD5、CD7、CD1a、cCD3NK細(xì)胞CD16、CD56、CD57漿細(xì)胞CD38、CD138、cκ、cλ、CD19、CD5614精選ppt根據(jù)骨髓細(xì)胞CD45/SSC圖中分布情況設(shè)門圈定各類細(xì)胞R1門為成熟淋巴細(xì)胞R2門為正常單核細(xì)胞位置R3門正常粒細(xì)胞位置R4門為幼稚淋巴細(xì)胞出現(xiàn)位置R5門為有核紅細(xì)胞或細(xì)胞碎片位置R6門為幼稚髓細(xì)胞出現(xiàn)位置白血病細(xì)胞通常會在R4R6兩門位置處出現(xiàn)正常成人骨髓樣本----CD45設(shè)門15精選pptAML-M116精選pptAML-M217精選pptAML-M318精選ppt結(jié)論：ANLL,建議結(jié)合染色體和分子生物學(xué)和形態(tài)學(xué)診斷M3。

19精選ppt結(jié)論：ANLL，伴單核細(xì)胞分化，免疫表型符合M4。20精選ppt結(jié)論：ANLL，伴單核細(xì)胞分化，免疫表型符合M5。21精選ppt結(jié)論：ANLL，建議結(jié)合形態(tài)學(xué)以確診M6。

22精選pptAML-M723精選pptB-ALL24精選pptT-ALL25精選pptEGILScoringSystemForBAL(>2points)ScoreB-lymphoidT-lymphoidMyeloid2CD79aCD3MPOcCD22Anti-TCRa/bAnti-TCRg/d1CD19CD2CD117CD20CD5CD13CD10CD8CD33CD10CD650.5TdTTdTCD14CD7/1aCD15/6426精選pptRequirementsforassigningmorethanonelineagetoasingleblastpopulationMyeloidlineageMyeloperoxidase(flowcytometry,immunohistochemistryorcytochemistry)orMonocyticdifferentiation(atleast2ofthefollowing:NSE,CD11c,CD14,CD64,)TlineageCytoplasmicCD3(flowcytometrywithantibodiestoCD3epsilonchain;immunohistochemistryusingpolyclonalanti-CD3antibodyzetachain,whichisnotT-cellspecific)orSurfaceCD3(rareinmixedphenotypeacuteleukemia)BlineageStrongCD19withatleast1ofthefollowingstronglyexpressed:CD79a,cytoplasmicCD22,CD10orWeakCD19withatleast2ofthefollowingstronglyexpressed:CD79a,cytoplasmicCD22,CD10MPAL(mixedphenotypeacuteleukemia)WHO202127精選pptCD19+CD22+CD10-CD15+(B-lineageALL)B-negative,CD64+CD14+/-CD33+(MonocyticLeukemia)TwoLeukemicPopulationsMonoblastsLymphoblasts結(jié)論：急性混合細(xì)胞白血病(AM-LL)28精選ppt二.白血病微小殘留病灶

〔MRD〕目的：判斷預(yù)后，指導(dǎo)個體化分層治療，預(yù)測復(fù)發(fā)29精選pptB-ALL:多數(shù)表達(dá)CD34、CD38dim、TDT、CD19、CD10str、CD20,這些標(biāo)志的任意組合CD34/CD22、CD34/CD20、TDT/CD10等，也可加上某些異常標(biāo)志如CD13、CD33、CD15即可將ALL細(xì)胞與正常骨髓和外周血細(xì)胞分開〔60～80%〕。T-ALL:TDT結(jié)合T細(xì)胞外表標(biāo)志如CD5或CD3，加上cCD3(90%).30精選pptAML:CD34、CD56、CD15在內(nèi)的多種組合，表達(dá)TDT、CD13、CD33與散射光及抗原密度，可確定殘留的AML細(xì)胞〔70～80%〕31精選pptLEUKEMIAATDIAGNOSISNORMALDAY290.039%32精選ppt2021.4.21,原始細(xì)胞占79.2%2021.5.18，MRD:1.09%CD19/CD33/CD10/CD2033精選ppt34精選ppt三.成熟淋巴細(xì)胞增殖性疾病35精選ppt慢性淋巴細(xì)胞白血病幼稚淋巴細(xì)胞白血病毛細(xì)胞白血病脾邊緣區(qū)淋巴瘤大顆粒淋巴細(xì)胞白血病皮膚T細(xì)胞淋巴瘤相關(guān)白血病…………循環(huán)淋巴細(xì)胞增殖性疾病這類疾病必須有流式細(xì)胞術(shù)的輔助診斷！36精選ppt正常淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞增殖性疾病(克隆擴增)TBNKoror確定克隆來源！37精選pptB-LPD:B淋巴細(xì)胞出現(xiàn)輕鏈的單一抑制性表達(dá)；

T/NK-CLPD:由于缺乏單克隆的標(biāo)記物，通過FCM診斷成為難點。38精選ppt正常單克隆雙克隆單克隆CD20+細(xì)胞39精選pptCD19+淋巴細(xì)胞增多的鑒別診斷DighieroG,HamblinTJ.Lancet,2021,371(March22),1017B-LPD(lymphoproliferativedisease)40精選ppt結(jié)論：CLL/SLL.41精選ppt結(jié)論：慢性B淋巴細(xì)胞增殖性疾病，建議進一步FISH檢測t(11;14)以確診MCL.42精選ppt結(jié)論：免疫表型符合HCL,建議結(jié)合形態(tài)學(xué)和臨床明確診斷。43精選ppt44精選ppt1、前驅(qū)T淋巴母細(xì)胞白血病/淋巴瘤〔T-ALL/T-LBL〕2、母細(xì)胞性NK細(xì)胞淋巴瘤3、慢性前淋巴細(xì)胞白血病/淋巴瘤〔T-CLL/T-PLL〕4、顆粒淋巴細(xì)胞白血病〔T-LGL〕5、侵襲性NK細(xì)胞白血病〔ANKCL〕6、成人T細(xì)胞淋巴瘤/白血病〔ATCL/L〕7、節(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤，鼻型〔NK/TCL〕8、腸病型T細(xì)胞淋巴瘤〔ITCL〕9、肝脾γδT細(xì)胞淋巴瘤10、皮下脂膜樣T細(xì)胞淋巴瘤11、菌樣霉菌病/賽塞里(Sezary)綜合征(MF/SS)12、間變性大細(xì)胞淋巴瘤(ALCL),T和非T非B細(xì)胞,原發(fā)性皮膚型13、周圍T細(xì)胞淋巴瘤(PTL)14、血管免疫母細(xì)胞T細(xì)胞淋巴瘤(AITCL)15、間變性大細(xì)胞淋巴瘤(ALCL),T和非T非B細(xì)胞,原發(fā)性全身型WHO2021成熟T/NK細(xì)胞腫瘤淋巴增殖性疾病分類45精選ppt免疫表型特征46精選ppt1.光散射信號的異常：FS

47精選ppt2.抗原喪失75％成熟腫瘤T細(xì)胞會喪失正?？乖瑿D7是最易發(fā)生喪失的抗原CD2和CD5也是經(jīng)常發(fā)生喪失的抗原48精選ppt3.抗原表達(dá)異常：如：伴CD10＋49精選ppt4.抗原表達(dá)強度異常：

50精選ppt正常：CD4/CD8=1.5-2.5:1腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)CD4或CD8某一個群體的限制性表達(dá)模式：

CD4+,CD8-CD4-,CD8+CD4+CD8+CD4-CD8-

多見5.細(xì)胞群體數(shù)量的異常增加以及抗原的限制性表達(dá)：51精選ppt52精選ppt常見T-CLPD免疫表型T-幼稚淋巴細(xì)胞白血病(T-PLL〕通常CD4+orCD4+CD8+,PB:>55%幼淋細(xì)胞杭XX,女/60,結(jié)果：異常淋巴細(xì)胞占47.4%，表達(dá)CD3-cCD3+CD4+CD8+CD5-占比例47.4%，表型符合T-PLL.53精選ppt血管免疫母細(xì)胞淋巴瘤(AITCL):CD4+CD2+CD5+CD10+CD26-,CD7-,CD3-常見T-CLPD免疫表型54精選ppt患者，丁XX,男/59

淋巴結(jié)骨髓結(jié)論:異常T淋巴細(xì)胞占78%,抗原表達(dá)異常(CD3-CD4+CD7-CD10+CD2+CD5+),提示T-CLPD55精選ppt外周T細(xì)胞淋巴瘤〔PTCL〕骨髓侵犯:CD4+,多數(shù)CD7-and/orCD5-常見T-CLPD免疫表型56精選ppt成人T細(xì)胞淋巴瘤〔ATLL〕:CD4+CD2+,其他T系抗原可有缺失局部伴有髓系抗原表達(dá)：CD13，CD33，CD15外周血：多形核淋巴細(xì)胞確診：HTLV-1基因陽性

常見T-CLPD免疫表型57精選pptT-LGLCD4+orCD8+，伴有NK抗原表達(dá)CD16+，CD57+，局部CD56+形態(tài)學(xué)：大顆粒淋巴細(xì)胞常見T-CLPD免疫表型58精選pptTCRVβ限制性表達(dá)1.包含24種抗體，兩種熒光素，識別70％Vβ亞家族；2.在診斷和MRD監(jiān)測中的作用59精選ppt60精選ppt61精選pptSTRUCTUREOFTCELLRECEPTORBecauseTCRisapartofCD3complex,vbetaanalysiscannotbeusedforsurfaceCD3-negativeTcells.62精選ppt局部病例運用免疫標(biāo)記物難以將惡性成熟T淋巴細(xì)胞從正常T淋巴細(xì)胞中精確鑒別(反響性或克隆性)。原因：1.腫瘤細(xì)胞被反響性T細(xì)胞掩蓋2.CD8+占優(yōu)勢群體還見于：V感染(AIDS,EBV)，BMT后

臨床特點對診斷更為重要！63精選ppt流式診斷NK細(xì)胞淋巴瘤典型：CD2+,CD16+,CD56+,CD122+,CD3-沒有特征性抗體區(qū)分腫瘤和反響性NK細(xì)胞：數(shù)量以及FSKIR：KIRs、CD94/NKG2；均一性表達(dá)KIR同種型64精選ppt四.陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿65精選ppt陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥〔PNH〕糖基化磷脂酰肌醇錨〔GPI〕連接的錨連蛋白缺乏補體介導(dǎo)的血管內(nèi)溶血為特征的獲得性造血干細(xì)胞克隆性疾病磷脂酰肌醇聚糖A(PIG－A)基因突變PIG－A基因突變對補體敏感性增高溶血錨連蛋白：補體調(diào)節(jié)蛋白CD55、CD59、CD16、CD24、CD14、Flaer等66精選ppt樣本收集：優(yōu)先選擇外周血，不推薦骨髓抗凝劑:EDTA、肝素RBC最多可存放至7天WBC必須在48小時內(nèi)檢測〔粒細(xì)胞上的抗原表達(dá)和散射會隨著時間而改變〕CCS指南推薦對>2種細(xì)胞系進行檢測

標(biāo)本類型

抗凝劑標(biāo)本儲存67精選ppt常規(guī)檢測：敏感度1%，獲取5000個目的細(xì)胞高敏檢測：敏感度0.01%，獲取250，000個目的細(xì)胞中性粒細(xì)胞：必做紅細(xì)胞：中性粒細(xì)胞檢出PNH克隆時必做，或全部標(biāo)本都做，但單獨檢測不推薦單核細(xì)胞：可提供穩(wěn)定的結(jié)果淋巴細(xì)胞：不推薦細(xì)胞獲取目的細(xì)胞68精選ppt抗體的選擇僅檢測CD55/CD59------不推薦敏感性：5-10%(Sutherlandandal,CytometryPartB72B:167-177)Flaer-----組成高特異性的PNHPanel

69精選ppt紅細(xì)胞分析：優(yōu)點：與WBC相比，RBC檢測能更好地鑒別II型細(xì)胞。缺點：輸血和溶血會造成PNH克隆大小檢測值偏低。

單檢測紅細(xì)胞不能充分評估PNHI型：正常紅細(xì)胞II型：CD59局部缺失的PNH克隆III型：CD59完全缺失的PNH克隆70精選ppt同個患者的紅細(xì)胞和粒細(xì)胞檢測結(jié)果粒細(xì)胞PNH克?。?4.5%紅細(xì)胞PNH克隆：6.1%溶血/輸血對PNH克隆大小的影響71精選ppt紅細(xì)胞分析-----抗體選擇和分析CD59優(yōu)于CD55CD59在紅細(xì)胞上的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于CD55結(jié)果分析：PNH細(xì)胞比較多時，適合使用直方圖異常細(xì)胞數(shù)少時，適合使用散點圖同一個患者，CD59能區(qū)分出II型和III型細(xì)胞，CD55那么不能紅細(xì)胞PNH克隆很少時，適合散點圖分析72精選ppt中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞都可以檢測。不適宜采用淋巴細(xì)胞白細(xì)胞分析-----

檢測PNH克隆最好的方法

73精選pptCD59—最早用于檢測粒系PNH克隆的標(biāo)記物FLAER-能和WBC上所有的GPI錨連蛋白特異性結(jié)合：當(dāng)前成為最正確標(biāo)記物CD14是表達(dá)在單核細(xì)胞上的GPI錨連蛋白，用于檢測單核細(xì)胞的PNH克隆。CD24是表達(dá)在粒細(xì)胞上的GPI錨連蛋白，用于檢測粒細(xì)胞的PNH克隆。白細(xì)胞分析-----

檢測PNH克隆最好的方法

74精選ppt什么是FLAER?FLAER(FLuorescentAERolysin〕，熒光標(biāo)記的嗜水氣單胞菌溶素，它不是單克隆抗體，而是滅活的細(xì)菌蛋白質(zhì)，能和WBC上所有的GPI錨連蛋白特異性結(jié)合。FLAERCD24FLAERCD1475精選pptICCSPNH指南:WBC檢測的組合Colors細(xì)胞類型1234563colorGFLAERCD24CD153colorMFLAERCD14CD334colorGFLAERCD24CD15CD