凝膠色譜親和色譜研究進(jìn)展及案例課件

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CollegeofFoodScience,SCAU修德博學(xué)求實創(chuàng)新凝膠、親和色譜目錄近期中國色譜研究進(jìn)展中國色譜研究進(jìn)展中國色譜最新動態(tài)凝膠、親和色譜案例分析凝膠過濾色譜親和色譜一、近期中國色譜研究進(jìn)展文章名：?近年中國色譜研究進(jìn)展?張祥民1、張麗華2、張玉奎2〔2003年院士〕作者單位：1.復(fù)旦大學(xué)2.中科院大連化物所發(fā)表期刊：?色譜?發(fā)表時間：2021年文章名：?近期色譜研究的最新動態(tài)和進(jìn)展?白泉作者單位：西北大學(xué)發(fā)表期刊：?色譜?發(fā)表時間：2021年1、中國色譜開展概況色譜歸屬于分析化學(xué)中的一個分支，其出現(xiàn)及開展至今已將近110年。色譜技術(shù)在生物制藥、蛋白質(zhì)組學(xué)、生物分子的別離分析方面都發(fā)揮著越來越重要的作用。20世紀(jì)末至今，是中國色譜學(xué)科全面快速開展的重要時期。WebofScience數(shù)據(jù)庫和“中國期刊全文數(shù)據(jù)庫〞和“萬方數(shù)據(jù)庫〞的檢索數(shù)據(jù)(2021年9月25日檢索)說明，1990年至2021年我國科技工作者在美國科學(xué)情報研究所科學(xué)引文索引收錄期刊(即SCI期刊)和中國科技期刊上發(fā)表色譜相關(guān)論文132604篇(其中SCI期刊論文27381篇，中國科技期刊數(shù)據(jù)庫論文105223篇)。色譜方法應(yīng)用于化學(xué)領(lǐng)域的論文數(shù)量占46%，生物化學(xué)與分子生物學(xué)領(lǐng)域的占21%，食品科學(xué)與技術(shù)領(lǐng)域的占5%，材料科學(xué)、工程學(xué)、微生物學(xué)領(lǐng)域的各占4%，環(huán)境科學(xué)、光譜學(xué)和藥理學(xué)領(lǐng)域的各占3%，上述領(lǐng)域之外的論文比例為8%。1990年至2021年，中國科學(xué)家所發(fā)表的色譜領(lǐng)域論文總數(shù)以28062篇的數(shù)量居世界第三位(第一名:美國，71008篇;第二名:日本，35035篇)。2021年發(fā)表論文4146篇，2021年發(fā)表4574篇，排名躍居世界第一。

涉及毛細(xì)管電泳〔CE〕、氣象色譜〔GC〕高效液相色譜〔HPLC〕論文增長態(tài)勢2、最新動態(tài)樣品前處理膜蛋白的疏水性強、溶解性差和豐度低，對它的別離分析是蛋白質(zhì)組學(xué)中的一大難題。復(fù)旦大學(xué)的劉寶紅教授課題組采用殼聚糖改性的介孔泡沫石墨烯(MGF-CS)作為納米反響器，從有機(jī)溶劑中高效富集疏水性膜蛋白并進(jìn)行原位酶解。將該技術(shù)應(yīng)用于實際樣品中膜蛋白的分析鑒定，采用二維液相色譜－質(zhì)譜方法(2D-LC-MS)可鑒定931種膜蛋白，而通常采用的水溶液中酶解法僅能鑒定73種膜蛋白。結(jié)果說明多功能的MGF-CS對蛋白質(zhì)組學(xué)中膜蛋白的分析鑒定具有重要的應(yīng)用價值。分子印跡技術(shù)是采用人工合成方法制備對目標(biāo)分子有特異性識別材料的技術(shù)。由于蛋白質(zhì)體積大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、易于變性，完整蛋白質(zhì)模板分子難以獲得且價格昂貴，因此限制了蛋白質(zhì)分子印跡材料的開展。中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所張麗華研究員課題組提出了一種蛋白質(zhì)抗原決定基分子印跡磁性納米材料的制備新方法?？乖瓫Q定基印跡是以目標(biāo)蛋白質(zhì)上一段特異性多肽為模板分子進(jìn)行印跡。由于模板肽段與目標(biāo)蛋白質(zhì)間存在極強的特異性，形成的印跡位點對模板肽段及目標(biāo)蛋白質(zhì)均具有特異性識別能力。金屬有機(jī)骨架化合物〔MOFs〕因具有比外表積大、結(jié)構(gòu)多樣性、孔道尺寸可調(diào)、骨架可修飾、熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性良好等優(yōu)點而廣泛應(yīng)用于別離分析等領(lǐng)域。西班牙BalearicIslands大學(xué)的Palomino課題組利用注射器設(shè)計了一種針管式自動磁性〔MOFs〕分散固相微萃取裝置。固定相多孔整體材料作為一種新型別離介質(zhì)，由于其具有制備簡便、通透性好、性能穩(wěn)定和易于修飾等特點而被譽為第四代色譜別離介質(zhì)。鄒漢法課題組開展了一種基于光引發(fā)巰基－丙烯酸酯點擊聚合反響的新方法，并成功制備了具有高別離性能的有機(jī)－硅膠雜化整體柱。與巰基－烯和巰基－甲基丙烯酸酯點擊聚合反響相似，光引發(fā)的巰基－丙烯酸酯點擊聚合反響不僅反響效率較高，速度快，而且反響條件非常溫和。加拿大卡爾加里大學(xué)的Thurbide小組將316不銹鋼粉末〔粒徑44~149μm〕填充于316不銹鋼毛細(xì)管柱內(nèi)作為支持體，將水泵入色譜柱中，建立了以水為固定相，CO2為流動相，與火焰離子化檢測器聯(lián)用的超臨界流體色譜別離體系〔SFC-FID〕。手性拆分德國萊比錫城大學(xué)的Belder小組將纖維素-三〔3，5－二甲基苯基氨基甲酸酯〕包覆的5μm全多孔SiO2手性固定相填充于微流控芯片的通道中，第一次利用填充的微流控芯片〔柱長58.4mm〕實現(xiàn)了幾種手性藥物的快速拆分，對力莫敵提取物在5s內(nèi)就可完成拆分。分析檢測澳大利亞悉尼大學(xué)的Handelsman小組采用1,2-二甲基咪唑-5-磺酰氯作為雌激素衍生化試劑，建立了一種利用LC-MS/MS同時測定血清中衍生化的雌二醇(E2)和未衍生化的睪酮(T)、二氫睪酮(DHT)的高靈敏檢測方法。蛋白質(zhì)組學(xué)美國Wisconsin-Madison大學(xué)的Ge小組耦合離子交換色譜/疏水色譜/反相色譜(IEC-HIC-RPC)3種色譜別離方法，構(gòu)建了三維液相色譜(3DLC)用于整體蛋白質(zhì)的別離，并證明3DLC(IEC-HIC-RPC)技術(shù)優(yōu)于傳統(tǒng)的2DLC(IEC-RPC)。二、凝膠、親和色譜案例分析1、凝膠過濾色譜〔凝膠色譜分為凝膠過濾色譜和凝膠滲透色譜〕文章名：?凝膠過濾色譜法測定嬰兒配方乳粉中α-乳白蛋白?賈云虹，宋曉青，楊凱作者單位：河北省三元食品發(fā)表期刊：?食品科技?發(fā)表時間：2021年?食品科技?〔FoodScienceandTechnology〕1975年創(chuàng)刊，北京市糧食科學(xué)研究所主辦，1996-2021年連續(xù)5屆中文核心期刊。背景α-乳白蛋白中富含色氨酸，色氨酸是人體必需氨基酸之一。食用α-乳白蛋白和食用酪蛋白的結(jié)果相比，大腦中的色氨酸含量比例高達(dá)48%，且減弱了中性氨基酸和色氨酸在穿過血腦屏障時的競爭。這些依據(jù)說明，在嬰兒配方乳粉中參加富含色氨酸的α-乳白蛋白，使其接近母乳中α-乳白蛋白的含量比例，是非常必要的。牛乳母乳80%酪蛋白+20%乳清蛋白60%乳清蛋白α-乳白蛋白濃度1.0~1.5g/L，占清蛋白的20%α-乳白蛋白是母乳清蛋白的主要成分，在成熟母乳中(30d后)的濃度為(2.44±0.64)g/Lα-乳白蛋白檢測方法方法優(yōu)點缺點聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)普適性最強操作復(fù)雜，測定周期長，重現(xiàn)性差，只能半定量。反相高效液相色譜(RP-HPLC)快速高效精準(zhǔn)、重現(xiàn)性穩(wěn)定只能檢測出天然的α-乳白蛋白離子交換液相色譜(FPLC)快速高效精準(zhǔn)需要預(yù)先把要乳清蛋白與酪蛋白分離才可以進(jìn)行毛細(xì)管凝膠電泳(CGE)定量分析可靠蛋白質(zhì)容易在石英毛細(xì)管上吸附，影響分離效率，甚至堵塞毛細(xì)管柱液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)靈敏度高、穩(wěn)定性好只能檢測非變性的α-乳白蛋白凝膠過濾色譜：根據(jù)蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量大小進(jìn)行別離，紫外吸收檢測。能檢測出嬰兒配方乳粉中非變性和在加工過程中變性的α-乳白蛋白總量，操作簡單，準(zhǔn)確度高。流動相：6mol/L鹽酸胍溶液，參加磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、EDTA，調(diào)pH=6.0，用0.45μm濾膜過濾。色譜條件：色譜柱TSK-2000SWXL凝膠色譜柱(7.8mm×300mm)；柱溫30℃；流動相流速0.5mol/L；檢測波長280nm?！踩毡綯OSOH公司生產(chǎn)的TSK-2000SWXL粒度5μm，孔徑125，可以測量分子量5,000～150,000?！硨嶒灧椒?zhǔn)確稱取含有大約相當(dāng)于10mg蛋白質(zhì)的樣品，樣品溶在盛有流動相溶液的10mL容量瓶中，超聲處理30min。從以上樣品中轉(zhuǎn)移1.5mL于10mL離心管中，參加10μLβ-硫基乙醇，搖動混合約10s，讓樣品在室溫下放置至少2h，用0.45μm微孔濾膜過濾至液相色譜進(jìn)樣瓶中，然后注射進(jìn)液相色譜。根據(jù)標(biāo)樣峰面積和濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計算樣品中α-乳白蛋白含量。選擇色譜柱α-乳白蛋白的相對分子質(zhì)量為14200u，而凝膠色譜柱TSK-2000SWXL別離樣品的相對分子質(zhì)量范圍為5000~150000u，因此選擇此色譜柱是比較適宜的。組成蛋白質(zhì)的氨基酸在210~280nm范圍內(nèi)都有不同程度的吸收，但只有色氨酸在280nm有足夠高的吸收，而α-乳白蛋白含有豐富的色氨酸，因此選擇280nm作為DAD的檢測波長，能獲得較好的靈敏度。回歸方程和檢出限稱取適量α-乳白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，用流動相配制成0.1、0.2、0.3、0.4mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列，按照1.3所述色譜條件進(jìn)行測定，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到α-乳白蛋白線性回歸方程：Y=8407.6X-90.26，線性相關(guān)系數(shù)：R2=0.9998。以信噪比S/N=3計算α-乳白蛋白的檢測限為2.8μg/mL，完全能滿足嬰兒配方乳粉中α-乳白蛋白含量的測定。嬰兒配方乳粉中α-乳白蛋白含量的測定2、親和色譜文章名：?親和色譜應(yīng)用于天然活性成分篩選的研究進(jìn)展?馮穎淑1，童珊珊2，徐希明2等作者單位：1中國藥科大學(xué)2江蘇大學(xué)發(fā)表期刊：?中國中藥雜志?發(fā)表時間：2021年親和色譜法(affinitychromatography)是一種利用固定相的結(jié)合特性來別離分子的色譜方法。早在1910年，德國藥理學(xué)家Starken-stein將蔗糖酶抗體吸附在高嶺土上，研究了抗體和抗原的相互作用，為親和色譜的萌芽。1924年，俄羅斯學(xué)者Engelhardt提出了“固定化配體原理〞，作為別離生物活性物質(zhì)的方法，為親和色譜別離方法的根本。1970年，Cuatrecases提出了“空間間隔臂〞概念和方法，成功解決了配位體的立體可接受性問題。1972年，德國學(xué)者Wulff提出分子印跡色譜方法，進(jìn)一步擴(kuò)展了親和色譜的應(yīng)用，使得親和色譜開始用于藥物篩選研究。1978年瑞典學(xué)者Ohlson提出以大孔微粒硅膠作為載體的高效液相親和色譜方法，使得親和色譜的開展跨入了一個新的時代。親和色譜法篩選技術(shù)受體為親和配基的色譜篩選酶為親和配基的色譜篩選血漿蛋白為親和配基的色譜篩選以DNA為親和配基的色譜篩選細(xì)胞膜色譜篩選脂筏色譜篩選分子印跡技術(shù)其他親和配基〔如核酸適配體親和色譜、免疫親和色譜、金屬離子親和色譜等等?！澄恼旅?殼聚糖螯合凝膠層析法純化血液超氧化物歧化酶?王保，全平娟，張永州等作者單位：河南大學(xué)，中科院生物物理研究所，蘭州大學(xué)發(fā)表期刊：?食品與生物技術(shù)學(xué)報?發(fā)表時間：2021年研究背景超氧化物歧化酶簡稱SOD，是廣泛存在于生物體內(nèi)的一種可防止氧化損傷和缺失的活性酶，也是一種應(yīng)用廣泛的藥用酶，具有抗衰老、預(yù)防輻射及治療炎癥等一系列功能，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品及醫(yī)藥衛(wèi)生行業(yè)。1975年proath首次提出固定化金屬螯合親和層析〔IMAC〕，利用固定在基質(zhì)上的過渡態(tài)金屬離子和蛋白質(zhì)外表的組氨酸、半胱氨酸、色氨酸等殘基的配位作用，來實現(xiàn)對金屬離子有親和力的蛋白質(zhì)的吸附和別離。在制備親和介質(zhì)時，常用的金屬離子有Cu2+，Zn2+和Ni2+等，常用的螯合配基有亞氨基二乙酸〔IDA〕，三羧基甲基乙二胺〔TED〕，次氨基三乙酸〔NTA〕等。固定化螯合親和色譜常常以凝膠為載體，如在SephadexG-75或者DEAE-superpose等凝膠上用化學(xué)交聯(lián)方法引入螯合劑IDA，再通過交聯(lián)固定和親和配〔Ba2+，Cu2+，Zn2+〕。用該方法制備的凝膠介質(zhì)生產(chǎn)本錢很高，軟基質(zhì)很易被壓縮，不易被放大生產(chǎn)。近年來，隨著基因工程下游技術(shù)的開展，基因重組蛋白質(zhì)的別離純化技術(shù)越來越顯示其重要性，金屬螯合層析技術(shù)〔IMAC〕分辨率高、選擇性好，能在常規(guī)的變性條件下及非變性條件下進(jìn)行蛋白質(zhì)組分別離純化。作者以殼聚糖為原料，以固定相偶聯(lián)的配基-亞氨基二乙酸〔IDA〕及金屬離子Cu2+發(fā)生螯合作用，制得金屬親和層析凝膠，改凝膠化學(xué)穩(wěn)定性好，基質(zhì)穩(wěn)定，容易再生，并首次以聚合高分子電解質(zhì)聚丙烯酸鈉對傳統(tǒng)血液超氧化物歧化酶提純工藝進(jìn)行改進(jìn)。實驗方法材料：新鮮豬血，檸檬酸三鈉，氯化銅，丙酮，聚丙烯酸〔PAA〕，不同相對分子質(zhì)量聚丙烯酸鈉〔PAAS〕，固含3.45%〔質(zhì)量分?jǐn)?shù)〕；殼聚糖，脫乙酰度≥90%，；SOD活性試劑盒，低相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，SOD標(biāo)準(zhǔn)品，臨苯三酚，SephedexG-75，DEAE-sepherose-fastflow4B。實驗步驟SOD的制備殼聚糖制備凝膠