米曲霉與黑曲霉復(fù)合制曲發(fā)酵醬油的研究

米曲霉與黑曲霉復(fù)合制曲發(fā)酵醬油的研究

在勘探過程中，發(fā)酵效果的質(zhì)量主要取決于微生物對原料中蛋白質(zhì)的利用。目前國內(nèi)醬油企業(yè)中,原料蛋白質(zhì)的利用率普遍只有75%~80%,而國際先進(jìn)水平國家的平均利用率已經(jīng)達(dá)到90%以上,為了縮短與國際先進(jìn)國家的差距,國內(nèi)相關(guān)人員做了大量的研究,研究發(fā)現(xiàn)通過多菌種復(fù)合發(fā)酵能有效提高原料的蛋白質(zhì)利用率。但是在復(fù)合菌種發(fā)酵中,微生物間相互作用既有互相促進(jìn)也有相互拮抗,而在這個(gè)相互作用的反應(yīng)過程中需要尋找到一個(gè)平衡點(diǎn),使復(fù)合菌種的協(xié)同發(fā)酵效率最高,最大限度地生產(chǎn)出人們需要的產(chǎn)物。因此,深入研究復(fù)合菌種在發(fā)酵過程中對原料蛋白質(zhì)的分解利用情況就顯得很有必要,本文對此進(jìn)行了初步的研究與分析。1材料和方法1.1其他微生物所需養(yǎng)食品米曲霉菌種:仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院生物工程實(shí)驗(yàn)室保藏菌種;As3.350黑曲霉:廣東省微生物所;大豆、面粉:廣東美味鮮調(diào)味食品有限公司;麩皮:廣東東海調(diào)味品有限公司;食鹽:廣東鹽業(yè)集團(tuán)袋裝低鈉鹽。1.2測試方法1.2.1大豆曲霉t-一種黑曲霉先以麩皮為主要原料,按8:1的比例加入大豆粉與面粉混合均勻,經(jīng)潤濕蒸煮冷卻后接種一定量的米曲霉或黑曲霉孢子,經(jīng)過約72h培養(yǎng)制成種曲;然后按1%的總種曲接種量,按米曲霉:黑曲霉比例分別為1:0、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1與30%的面粉混合接入經(jīng)浸透蒸煮的大豆中,經(jīng)72h培養(yǎng)制成成曲;最后把成熟的成曲平均分裝到三角瓶,分別添加2.5倍的18%的鹽水,30℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)并定期搖瓶。1.2.2氨基酸態(tài)氮測定考察樣品前30d蛋白質(zhì)分解情況,從發(fā)酵0d開始,每隔5d取一次樣測定其氨基酸態(tài)氮含量,氨基酸態(tài)氮根據(jù)GB18186—2000方法測定。1.2.3全氮利用率的測定分別測定原料與30d發(fā)酵完成后醬油中的全氮含量,根據(jù)GB18186—2000所提供的方法測定。根據(jù)下列公式計(jì)算出全氮利用率。2結(jié)果與分析2.1各單菌種與復(fù)合菌種發(fā)酵的分解效率及復(fù)合比例的確定在30d的發(fā)酵周期內(nèi),從制醪開始每隔5d跟蹤測定一次各組樣品的氨基酸態(tài)氮含量,所得各組的氨基酸態(tài)氮生成曲線如圖1~圖6所示。根據(jù)圖1~圖6顯示的結(jié)果,發(fā)酵前30天原料的蛋白質(zhì)都在不斷地分解成氨態(tài)氮,而前5d的分解效率最高,不同的菌種配比所表現(xiàn)出來的趨勢基本一致。第5~10天的時(shí)間段里,單菌種發(fā)酵組仍然保持了較高的分解效率,5d內(nèi)分解產(chǎn)生氨態(tài)氮超過了0.21g/100mL,其他各組樣品的分解效率則有一定的下降,5d分解產(chǎn)生氨態(tài)氮基本都在0.168g/100mL以下,其中1:1組的分解效率最高,其他各組依次是5:1、4:1、3:1和2:1,總的來說,0~10d這個(gè)時(shí)間區(qū)間內(nèi),除1:1組外,米曲霉占優(yōu)勢的樣品分解效率相對較高,米曲霉的優(yōu)勢越明顯其分解效率則越高。而第10天開始,單菌種與1:1組的分解效率有了明顯的下降,從第10到第30天單菌種發(fā)酵只生成了0.231g/100mL氨態(tài)氮,而1:1組只分解產(chǎn)生了0.182g/100mL,其他各組的氨態(tài)氮產(chǎn)量分別為2:1組產(chǎn)生了0.341g/100mL,3:1組產(chǎn)生了0.238g/100mL,4:1組產(chǎn)生了0.392g/100mL,5:1組產(chǎn)生了0.322g/100mL,可以看到4:1這個(gè)比例的后續(xù)發(fā)酵能力最強(qiáng),然后是2:1與5:1,在復(fù)合菌種中1:1與3:1的后續(xù)發(fā)酵力最弱與單菌種相當(dāng)或不如單菌種發(fā)酵。發(fā)酵30d后,最終產(chǎn)物中氨基酸態(tài)氮的含量如表1所示。從表1中可以看出,最終產(chǎn)物中氨基酸態(tài)氮含量最高的是4:1復(fù)合菌種然后依次是5:1、單菌種、1:1、2:1、3:1,最終發(fā)酵生產(chǎn)氨態(tài)氮比單菌種發(fā)酵高的只有4:1與5:1兩組。從以上結(jié)果中可以看出,單菌種發(fā)酵中酶解作用主要集中在前10d,后續(xù)的發(fā)酵相對比較緩慢;而復(fù)合菌種發(fā)酵中,不同的復(fù)合比例所表現(xiàn)出來的發(fā)酵過程有很大的差別,而最終結(jié)果優(yōu)于單菌種發(fā)酵的只有4:1與5:1兩組試驗(yàn),其他組的結(jié)果都不如單菌種發(fā)酵?？梢钥闯?復(fù)合菌種發(fā)酵高鹽稀態(tài)醬油需選擇合適的復(fù)合比例,比例合適能得到較好的效果,但如果比例不合適將有可能產(chǎn)生相反的作用,不利于生產(chǎn)。從以上結(jié)果可以初步判定,米曲霉與黑曲霉以4:1的比例混合制曲,其協(xié)同效應(yīng)最好,能明顯提高發(fā)酵產(chǎn)物中的氨基酸態(tài)氮含量,發(fā)酵30d后,其產(chǎn)品中氨基酸態(tài)氮的含量比單菌種發(fā)酵提高了約7.8%。2.2不同菌株在發(fā)酵過程中的發(fā)酵能力從另一個(gè)側(cè)面分析,在經(jīng)歷同樣的發(fā)酵時(shí)間后,各試驗(yàn)組的相互關(guān)系也在發(fā)生著一定的變化,以下通過圖7~圖13的對比分析探討當(dāng)中的變化與可能的影響原因。以上結(jié)果可以看到,0d和5d的柱狀圖顯示了1:1的優(yōu)勢比較大,盡管其氨基酸態(tài)氮的含量直到第20天仍然是最高的,但是與其他試驗(yàn)組的差距卻被不斷的縮小,到10d后其氨基酸態(tài)氮的增長速度就明顯不如其他實(shí)驗(yàn)組了,因此可以看到,該組的制曲效果比其他組要好,但是到液態(tài)發(fā)酵期間的發(fā)酵力就比較欠缺了。而2:1與3:1兩組試驗(yàn)基本上都處在較低的水平,盡管氨態(tài)氮的含量有一定的變化,但是與其他試驗(yàn)組相比水平都相對比較低,而且比單菌種發(fā)酵都要差,可見其復(fù)合菌種的協(xié)同性比較低不利于原料蛋白的分解利用。通過對比第0、5、10天的的柱狀圖可以看出,單菌種的發(fā)酵效率在制醪的初期階段是比較高的,但到15d后就被4:1與5:1兩組趕上了,暴露出了后期發(fā)酵能力不足的問題,綜合其他資料顯示,這與醬醪的理化指標(biāo)的變化有著一定的關(guān)系。從25、30d的柱狀圖可看出,4:1與5:1的后發(fā)酵能力已經(jīng)比較明顯地表現(xiàn)出來了,而其中4:1的結(jié)果是最理想的。2.3全氮利用率高,但氨態(tài)氮含量高,全氮利用率高經(jīng)過30d的發(fā)酵后,各試驗(yàn)組最終的全氮利用率見表2。如表2所示,4:1的全氮利用率最高,高達(dá)82.21%,與單菌種相比高出了35%,但是表2的數(shù)據(jù)與2.1和2.2中所得到的數(shù)據(jù)有一定的出入,特別是3:1、1:1以及2:1組的全氮利用率都超過了單菌種發(fā)酵組,但其氨態(tài)氮含量都低于單菌種發(fā)酵。初步分析,測定全氮的樣品中有可能混入了菌體自溶的部分氮源,由于1:1、2:1和3:1的后發(fā)酵能力都不強(qiáng),極有可能提前進(jìn)入了菌體的衰退期出現(xiàn)菌體自溶的現(xiàn)象,另外也可能由于過濾不干凈混入了部分原料的發(fā)酵殘留物,從而導(dǎo)致上述情況的出現(xiàn)。3發(fā)酵配比對原料分解利用的影響通過上述試驗(yàn)結(jié)果的對比分析,可以得出以下結(jié)論:在高鹽稀態(tài)醬油中,通過復(fù)合菌種制曲發(fā)酵既有可能產(chǎn)生正效應(yīng)也有可能產(chǎn)生負(fù)效應(yīng),關(guān)鍵在于找到一個(gè)協(xié)同性好的復(fù)合比例,若配比不合理,其原料蛋白的分解利用情況還不如單菌種制曲發(fā)酵的好;單菌種制曲發(fā)酵的蛋白分解利用主要集中在前10d,但單菌種制曲發(fā)酵的后續(xù)發(fā)酵能力相對較弱,不利于提高原料蛋白質(zhì)的分解