海狗油對(duì)實(shí)驗(yàn)性脂肪肝的抑制作用

海狗油對(duì)實(shí)驗(yàn)性脂肪肝的抑制作用

海狗油含有20碳5烯酸（epa）、22碳5烯酸（dpa）和22碳6烯酸（da）-3脂肪酸。這是人類必須的脂肪酸。它會(huì)抑制生長(zhǎng)四烯酸（aa、-6.00）的代謝，并在各種組織的官僚機(jī)構(gòu)中代謝相應(yīng)的前列腺素（pgs）、丙基二醇（mda）、血糖素（txs）、前列環(huán)素（pgi）和白三烯（lts）。它被稱為20噸類丙烯酸鈉（eit），具有抗血小板聚集、血管擴(kuò)張和抗炎免疫等作用。本文從海狗油對(duì)肝脂和肝內(nèi)血栓素A2代謝產(chǎn)物及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物MDA的影響等方面,探討海狗油對(duì)實(shí)驗(yàn)性脂肪肝病的作用機(jī)理。1材料和方法1.1藥物、試劑和儀器海狗油有效成份EPA、DPA和DHA的含量大于25%,由本實(shí)驗(yàn)室精制純化;辛伐他汀(simvastatin)50mg/片腸溶衣片,杭州默沙東制藥有限公司生產(chǎn)。血栓素B2(TXB2)和6-酮-前列腺素F1α(6-keto-PGF1α)放免藥盒,中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免研究所;MDA、游離脂肪酸(FFA)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒,北京幫定泰克生物技術(shù)有限公司;總膽固醇(TC)、肝油三酯(TG)檢測(cè)試劑盒,北京中生生物工程高技術(shù)公司。1.2動(dòng)物合格號(hào)Wistar大鼠,SPF級(jí),體重130～150g,♂,動(dòng)物合格證號(hào):京動(dòng)許字(2000)第017號(hào),由中國(guó)藥品生物制品檢定所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室為二級(jí)。1.3藥代動(dòng)力學(xué)—儀器日立U-3310紫外可見分光光度計(jì);BECKMANGS-15R低溫離心機(jī);OLYMPUS-BX51生物顯微鏡;SN-695B智能放免γ測(cè)量?jī)x,上海核所日環(huán)光電儀器有限公司。1.4高脂飼料的飼料除10只大鼠作為空白組(始終喂基礎(chǔ)飼料)外,其余大鼠于試驗(yàn)d1后肢內(nèi)側(cè)皮下一次性注射40%四氯化碳的橄欖油溶液3ml·kg-1,并飼以高脂飼料(脂肪20%,膽固醇1%,脫氧膽酸鈉0.2%,丙硫氧嘧啶0.2%,基礎(chǔ)飼料78.6%)。7周后,脂肪肝大鼠(解剖2只大鼠,病理檢查模型成立)按體重隨機(jī)分為模型組、辛伐他汀4mg·kg-1·d-1組、海狗油0.5、1.6和4.8g·kg-1·d-1組,每組10只,每組分別ig等體積橄欖油、辛伐他汀4mg·kg-1·d-1、海狗油0.5、1.6和4.8g·kg-1·d-1,連續(xù)8周。1.5mda及sod活力測(cè)定最后一次給藥后大鼠隔夜禁食,股動(dòng)脈放血處死取血,分離血清,按試劑盒要求,MDA用硫代巴比妥酸(TBA)比色法、SOD用黃嘌呤氧化酶法,測(cè)定MDA含量及SOD活力。1.6肝組織病理學(xué)檢測(cè)大鼠處死后迅速剖腹取肝,用濾紙濾干血水,每只取相同部位肝組織100mg,4℃下制備2%異丙醇的肝均漿液,3000r·min-1離心15min,取上清液按說明書要求測(cè)定TC、TG、MDA。同法取肝組織200mg,4℃下制備10%的生理鹽水肝勻漿液,離心取上清液按說明書要求測(cè)定SOD和FFA(酶比色法);另取上清液0.5ml,負(fù)壓吹干,臨測(cè)時(shí)加0.5ml生理鹽水復(fù)溶,按試劑盒要求,用放免法測(cè)定6-keto-PGF1α和TXB2。1.7cyp2e1免疫組織化學(xué)染色肉眼觀察肝臟后,取肝左葉一半迅速制作冰凍切片、蘇丹Ⅲ染色。另一半肝組織常規(guī)石臘包埋切片,CYP2E1免疫組織化學(xué)染色,于光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果,并以生物圖像分析系統(tǒng)軟件(北京清大德人科技有限公司)處理顯色結(jié)果進(jìn)行定量分析,以顯色指數(shù)表示。1.8統(tǒng)計(jì)處理所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,組間比較用t檢驗(yàn),各指標(biāo)之間的相關(guān)性采用兩因素的相關(guān)分析。2結(jié)果2.1對(duì)tc、tg和ffa含量的影響模型組大鼠肝臟的TC、TG和FFA含量較空白組增加(P<0.01),而海狗油0.5、1.6和4.8g·kg-1·d-1組TC、TG和FFA含量較模型組均有顯著降低(P<0.01),與辛伐他汀組相近(P>0.05);比模型組TC降低67%～87%、TG降低24%～51%、FFA降低1%～24%,表明海狗油減輕了肝臟的脂變程度(表1)。2.2不同處理對(duì)海狗油營(yíng)養(yǎng)成分的影響脂肪肝模型組比空白組大鼠肝臟的6-keto-PGF1α/TXB2比值降低94%(P<0.01),而海狗油4.8g·kg-1組較模型組TXB2含量降低67%(P<0.01),6-keto-PGF1α含量升高174%(P<0.01),6-keto-PGF1α/TXB2比值增加713%(P<0.01,表2),即TXA2(不穩(wěn)定而水解為TXB2)含量降低,PGI(不穩(wěn)定氧化為6-keto-PGF1α)含量升高,表明TXA2抗血小板的粘附和聚集作用及PGI舒張血管的作用增加,提示海狗油與AA競(jìng)爭(zhēng)抑制其代謝,使肝的血液流動(dòng)性增加。2.3無砂混凝土面為0.0的情況模型組血清和肝臟的MDA比空白組均升高(P<0.01),SOD活力降低(P<0.01);海狗油0.5、1.6和4.8g·kg-1·d-1組比模型組肝臟的MDA降低40%～83%(P<0.01),SOD活力升高35%～102%(P<0.01),表明海狗油有抗氧化、增強(qiáng)SOD活力的作用(表3)。2.4大鼠肝臟重、輕脂肪變性模型蘇丹Ⅲ染色與CYP2E1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果相近:空白組大鼠蘇丹Ⅲ染色均為陰性,CYP2E1染色基本為陰性即肝臟無脂肪變性;模型組大鼠均為強(qiáng)陽性,出現(xiàn)肝細(xì)胞重度彌漫性脂肪變性;海狗油各劑量組和辛伐他汀組脂肝細(xì)胞數(shù)目減少。以生物圖像分析系統(tǒng)定量測(cè)定CYP2E1表達(dá)強(qiáng)度的顯色指數(shù),可清楚地看出模型組顯色指數(shù)最大,海狗油0.5、1.6和4.8g·kg-1·d-1組隨劑量增大顯色指數(shù)逐漸減小,CYP2E1表達(dá)受到抑制(圖1)。2.5-keto-pgf1與肝脂tc、tg、fps-nf1蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析TXB2與肝TC、TG、FFA、CYP2E1表達(dá)的顯色指數(shù)、血清MDA和肝臟MDA呈正相關(guān),與血清SOD和肝臟SOD呈負(fù)相關(guān);而6-keto-PGF1α與肝脂TC、TG和FFA、CYP2E1表達(dá)的顯色指數(shù)、血清MDA和肝臟MDA之間呈負(fù)相關(guān),與血清SOD和肝臟SOD呈正相關(guān)(圖2)。這進(jìn)一步提示海狗油具有抑制血小板聚集和舒張血管的作用,使肝內(nèi)血液流動(dòng)增加,從而促進(jìn)肝脂代謝,抗脂質(zhì)過氧化。3海狗油對(duì)肝臟脂代謝的影響文獻(xiàn)報(bào)道肝內(nèi)血液流動(dòng)減慢,使肝竇狀腺阻塞是造成脂肪肝的原因之一。EPA(也稱為花生五烯酸)已被證實(shí)與AA競(jìng)爭(zhēng)抑制其代謝過程,而抑制血小板聚集和舒張血管,使肝內(nèi)血液流動(dòng)增加,但海狗油能否具有同效?本實(shí)驗(yàn)證實(shí)中、高劑量海狗油使大鼠肝臟TXB2含量顯著降低,6-keto-PGF1α值顯著增加,即AA代謝產(chǎn)物TXA2降低,PGI增加,表明改善了微循環(huán),降低了血液粘度,使肝的血液流動(dòng)性增加,從而間接降肝脂。大量氧自由基及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生,直接損傷各種生物膜,氧化細(xì)胞膜的蛋白,導(dǎo)致肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的損害,干擾肝內(nèi)脂代謝,MDA也是AA的代謝產(chǎn)物之一,而海狗油與AA競(jìng)爭(zhēng)抑制其代謝過程。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)海狗油使CYP2E1表達(dá)下調(diào),肝細(xì)胞內(nèi)MDA濃度降低,SOD活性逐漸升高,有抗氧化作用,防止肝細(xì)胞的脂肪變性和肝臟損傷,促進(jìn)肝內(nèi)脂代謝。文獻(xiàn)報(bào)道海狗油能提高肝臟脂代謝關(guān)鍵酶脂蛋白脂酶和低密度脂蛋白(LDL)受體的活性,促進(jìn)脂代謝,抑制TG合成限速酶的活性,減少肝內(nèi)TG的合成,而直接降肝脂。本實(shí)驗(yàn)證明海狗油可使肝內(nèi)TC、TG、FFA含量下降,減輕了肝臟脂變程度。本實(shí)驗(yàn)從上述三個(gè)方面說明海狗油對(duì)脂肪肝抑制