轉(zhuǎn)基因小鼠技-術(shù)資料課件

轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)---轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建基因打靶的簡易程序23優(yōu)點(diǎn)：外源基因整合情況的可控性高可預(yù)先在細(xì)胞水平檢測外源基因的拷貝數(shù)、定位、表達(dá)的水平及插入的穩(wěn)定性外源基因?qū)隕S細(xì)胞的方法多樣，細(xì)胞鑒定及篩選方便缺點(diǎn)：ES細(xì)胞系建立及培養(yǎng)困難維持ES細(xì)胞的未分化及多向分化潛能不易所得個(gè)體為嵌合體胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）法2023/10/24主要是利用反轉(zhuǎn)錄病毒的長末端重復(fù)序列(LTR)區(qū)域具有轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子活性的特點(diǎn),將外源基因連接到LTR下游進(jìn)行基因重組后,再包裝成為高滴度病毒顆粒,去直接感染受精卵或顯微注入囊胚腔中,攜帶外源基因的反轉(zhuǎn)錄病毒DNA可以整合到宿主染色體上。3、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法2023/10/2563、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法優(yōu)點(diǎn)

由于反轉(zhuǎn)錄病毒的高效率感染和在宿主細(xì)胞DNA中的高度整合特性, 大大提高基因轉(zhuǎn)移的效率

細(xì)菌質(zhì)粒和噬菌體載體只能將目的基因運(yùn)載至細(xì)菌中擴(kuò)增和表達(dá)。病毒載體是較理想的真核基因工程載體缺點(diǎn)

獲得純合體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的機(jī)會(huì)少

病毒載體構(gòu)建復(fù)雜

轉(zhuǎn)入的外源基因的大小受到限制,

<10kb

轉(zhuǎn)入病毒自身基因的復(fù)制表達(dá)2023/10/274、體細(xì)胞核移植法

首先將目標(biāo)基因轉(zhuǎn)移到體外培育的動(dòng)物體細(xì)胞中,篩選出陽性轉(zhuǎn)基因細(xì)胞并進(jìn)行繁殖,制備出供移植用的細(xì)胞核供體。然后將轉(zhuǎn)基因細(xì)胞核供體移植到去核的卵母細(xì)胞中,重構(gòu)胚胎經(jīng)過激活和培養(yǎng)后,移植到代孕小鼠中

1997年,英國Roslin研究所的Wilmut等利用成年綿羊乳腺上皮細(xì)胞作為核供體,成功獲得了體細(xì)胞克隆綿羊多莉(Dolly),拉開了動(dòng)物體細(xì)胞克隆技術(shù)的序幕。4、體細(xì)胞核移植法2023/10/282023/10/29優(yōu)點(diǎn)

減少受體動(dòng)物的數(shù)目,不需要用受體母畜來承擔(dān)那些非轉(zhuǎn)基因的胚胎,表現(xiàn)了強(qiáng)大的生命力。

事先在細(xì)胞中進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移和對陽性細(xì)胞進(jìn)行篩選,簡化了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)的許多環(huán)節(jié),節(jié)約了人力,具有很大的優(yōu)越性。缺點(diǎn)

體細(xì)胞克隆技術(shù)近年來發(fā)展勢頭十分迅猛,但在基礎(chǔ)理論和實(shí)驗(yàn)技術(shù)上還需進(jìn)一步探索。4、體細(xì)胞核移植法2023/10/2105、精子載體法

將精子與外源DNA進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)之后,使精子有能力攜帶外源基因進(jìn)入卵中,受精后進(jìn)行胚胎移植,這樣產(chǎn)生的動(dòng)物也會(huì)使外源基因得到表達(dá)。

精子攜帶DNA的途徑外源DNA與精子共孵育電穿孔導(dǎo)入法脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法2023/10/211優(yōu)點(diǎn)

基因轉(zhuǎn)化方法簡便,效率高

動(dòng)物育種不經(jīng)過嵌合體,實(shí)驗(yàn)周期短缺點(diǎn)

目的基因整合的隨機(jī)性

無法早期驗(yàn)證修飾事件

成功率不高、效果不穩(wěn)定5、精子載體法2023/10/2126、YAC法（人工酵母染色體法）優(yōu)點(diǎn)：

克隆百萬堿基對(Mbp) 級的大片段外源DNA 的能力,可以保證巨大基因的完整性;

保證所有順式作用因子的完整并與結(jié)構(gòu)基因的位置關(guān)系不變;

保證較長的外源基因片段在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究中整合率的提高;

鑒于基因的完整性,目的基因上下游的側(cè)翼序列可以消除或減弱基因整合的位置效率。缺點(diǎn)：

不穩(wěn)定，制備工藝繁瑣。2023/10/2137、BAC法（人工細(xì)菌染色體法）建立在大腸桿菌的F因子上的BAC載體：外源DNA可>300kb。F因子（F質(zhì)粒）是一種“性質(zhì)?！?，可轉(zhuǎn)移至F-宿主細(xì)胞。

100kb,近百個(gè)蛋白質(zhì)。

可構(gòu)建BAC文庫；

有單一的loxp位點(diǎn)，利于圖譜分析（借助標(biāo)記loxp和cre重組酶；BAC載體兩端有Sp6和T7 引物序列利于測序，確定基因的染色體定位；

可穩(wěn)定遺傳，易于操作。BAC文庫：基因組酶切后100～300kbDNA+BAC

大腸桿菌2023/10/214方法顯微注射核移植胚胎干細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄病毒基因敲除精子介導(dǎo)優(yōu)點(diǎn)外源基因整合效率較高，不轉(zhuǎn)基因效率高；預(yù)測基外源DNA的整合率高；可在整合點(diǎn)整合轉(zhuǎn)移基該方法簡單、方便需要載體，目因表達(dá)水平；整合在生殖因的單個(gè)拷的基因的長度可以使用定細(xì)胞中的比貝；可達(dá)100Kb點(diǎn)整合技術(shù)例也很高。缺精密儀器，供體細(xì)胞易ES細(xì)胞株不插入的基因應(yīng)用有些結(jié)果點(diǎn)技術(shù)操作較難，衰老易建立，長有大小限度；具有不能重復(fù)易造成宿主動(dòng)期培養(yǎng)后出嵌合性很高；一定物基因組的插現(xiàn)分化現(xiàn)象；外源DNA在局限入突變生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基動(dòng)物各種組性因動(dòng)物都是織中的分布嵌合體不均基因轉(zhuǎn)移方法的比較Electroporation2023/10/2152023/10/2162023/10/2172023/10/2182023/10/2191632023/10/220245125632023/10/22142023/10/2222023/10/2232023/10/2242023/10/225轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)---轉(zhuǎn)基因小鼠在科研中的應(yīng)用1.

7500萬－1.25億年前--人鼠始祖小鼠的歷史19世紀(jì)--寵物鼠---實(shí)驗(yàn)鼠的“先驅(qū)”1897年--重組表型2023/10/2261900年--從寵物鼠到實(shí)驗(yàn)鼠Abbie

Lathrop----飼養(yǎng)寵物鼠1902年，William

Ernest

Castle購買老鼠，用于遺傳學(xué)研究。哈佛大學(xué)---老鼠的毛色進(jìn)行觀察，以檢測孟德爾法則的正確性。1905年--孟德爾老鼠通過對黃白相間的雜色鼠進(jìn)行研究，法國遺傳學(xué)家

Lucien

Claude

Cuéno

發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)攜帶黃色皮毛基因的老鼠之間交配，其子代老鼠中黃色老鼠和白色老鼠的數(shù)量比總是2:1。--這是報(bào)道的第一個(gè)等位純合致死的基因。小鼠的歷史2023/10/2271909年--實(shí)驗(yàn)鼠的誕生Clarence

Cook

Little是一個(gè)來自于WilliamCastle

實(shí)驗(yàn)室的哈佛大學(xué)生物學(xué)家，他培育出了第一個(gè)近親繁殖的小鼠株系――DBA。1916年--腫瘤易受性和組織相容性Clarence

Little

和Ernest

Tyzzer

發(fā)現(xiàn)在同一株系小鼠間進(jìn)行腫瘤移植不會(huì)產(chǎn)生排斥現(xiàn)象，但不同株系間的移植則會(huì)發(fā)生排斥反應(yīng)。Jackson實(shí)驗(yàn)室的George

Snell在1940年代發(fā)現(xiàn)了組織相容性基因---榮獲了1980年的諾貝爾獎(jiǎng)2023/10/228小鼠的歷史1921年--C57BL株系基因組測序在2002年完成1929年--Jackson實(shí)驗(yàn)室---世界上最重要的小鼠遺傳學(xué)研究中心在Hudson

汽車公司的頭目Edsel

Ford和Roscoe

Jackson兩位大財(cái)主的資助下，

Charence

Little

在美國緬因州BarHarbor

建立了Jackson

實(shí)驗(yàn)室小鼠的歷史2023/10/22910.

1953年--DNA雙螺旋Crick，Watson和Wilkins三人因?yàn)檫@項(xiàng)杰出的成就榮獲了1962年的諾貝爾獎(jiǎng)。11.1966年--遺傳密碼破譯Robert

Holly，Har

Gobind

Khorana

和Marshall

Nirenberg

破譯了遺傳密碼---1968年的諾貝爾獎(jiǎng)小鼠的歷史2023/10/2301972年---小鼠遺傳學(xué)的計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫Jackson

實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)了第一個(gè)哺乳動(dòng)物遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫1977年--Sanger

測序法和同事Walter

Gilbert分享了1980年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)---人類和小鼠基因組測序過程中的主要技術(shù)1982年--轉(zhuǎn)基因小鼠小鼠的歷史2023/10/2312023/10/2321983年--PCRKary

Mullis--1993年的諾貝爾獎(jiǎng)1987-89年--第一只基因敲除小鼠Martin

Evans，Oliver

Smithies

和Mario

Capecch

領(lǐng)導(dǎo)的幾個(gè)研究小組---2001獲得了Lasker獎(jiǎng)1996年--“百慕大法則”公共基因組序列數(shù)據(jù)1998年--克隆鼠1997年克隆羊“多莉”誕生之后，夏威夷的一個(gè)小組培育出了第一批克隆鼠——“Cumulina”和她的姐妹們。小鼠的歷史1999年--小鼠基因組測序協(xié)會(huì)人類基因組三個(gè)主要測序中心（The

Wellcome

Trust

Sanger

Institute,The

Whitehead

Center

for

Genome

Research

和Washington

University

Genome

Sequencing

Center）成立了一個(gè)相互協(xié)作的小鼠基因

組測序機(jī)構(gòu)，取名為小鼠基因組測序協(xié)會(huì)（MouseGenome

Sequencing

Consortium,MGSC)2001年2月--人類基因組2001年6月--散彈法美國公司Celera

Genomics

使用散彈法測得了用于銷售的小鼠序列草圖。散彈法是一種一次性測得基因組全序列的技術(shù)。小鼠的歷史2023/10/2332023/10/2342002年5月--16號染色體與已被分析的人類21號染色體序列高度相似2002年8月--小鼠基因組物理圖譜2002年12月--小鼠基因組小鼠基因組測序協(xié)會(huì)發(fā)表了一份高質(zhì)量的小鼠基因組序列草圖，并且同時(shí)對C57BL/6J小鼠株系做了分析。這個(gè)基因組大小約為

2.5Gb，比人類基因組要小，預(yù)計(jì)的基因也少于30000個(gè)。約有40%的小鼠和人類基因組序列相高度似性，80%的人類基因在小鼠基因組中能找到相應(yīng)的基因。同時(shí)還有不少文章對小鼠遺傳組成的其它方面做了詳細(xì)討論。在日本RIKEN

基因組科學(xué)實(shí)驗(yàn)室的努力下，很多相關(guān)的重要資源都能夠被免費(fèi)獲取。小鼠的歷史2023/10/235轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)的應(yīng)用基因表達(dá)調(diào)控、基因功能及發(fā)育調(diào)控作用的研究基因工程定向育種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器研制人類疾病小鼠模型與基因治療藥理學(xué)研究器官移植環(huán)境科學(xué)研究2023/10/236基因表達(dá)調(diào)控、基因功能及發(fā)育調(diào)控作用的研究Hox

gene(同源異形盒基因）疾病基因?qū)W習(xí)與記憶基因生理周期基因基因表達(dá)有時(shí)空與組織的特異性；外源基因的表達(dá)受特異性有關(guān)順式作用序列的調(diào)控；2023/10/237基因工程定向育種向動(dòng)物體轉(zhuǎn)移外源基因并使之在動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)，能夠克服物種間固有的生殖隔離，實(shí)現(xiàn)動(dòng)物育種之間遺傳物質(zhì)的交換。實(shí)質(zhì)是將基因轉(zhuǎn)移與傳統(tǒng)育種方法結(jié)合，各取其精華，快速創(chuàng)造新的目的變異和固定擴(kuò)展變異，從而快速培育出高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)和抗逆動(dòng)物品種。轉(zhuǎn)基因羊、豬、雞、魚、鼠等2023/10/238轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器概念：將具某種重要應(yīng)用價(jià)值的生物活性蛋白基因?qū)雱?dòng)物受精卵或早期胚胎，培育轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，使外源基因在動(dòng)物的特定組織內(nèi)高效表達(dá)，再從這些組織的分泌液、浸出液或血清中分離提取目的基因產(chǎn)物。乳腺---理想器官腎臟和膀胱多肽藥物、蛋白質(zhì)疫苗、酶類細(xì)菌-動(dòng)物細(xì)胞-轉(zhuǎn)基因動(dòng)物2023/10/239乳腺生物反應(yīng)器具有以下特點(diǎn)：⑴乳腺是自我封閉系統(tǒng)，乳腺表達(dá)的蛋白質(zhì)不回流到血液循環(huán)系統(tǒng)，避免外源基因表達(dá)的蛋白質(zhì)對動(dòng)物本身的影響；⑵乳腺組織是一種有效的蛋白質(zhì)合成器；一頭奶牛一年可生產(chǎn)乳蛋白250—300Kg，一只綿羊或山羊一年可生產(chǎn)乳蛋白25—30Kg。如果有百分之一的乳蛋白代換成醫(yī)用蛋白，產(chǎn)量十分可觀。⑶乳腺分泌的基因產(chǎn)物不但產(chǎn)量高，而且易提純。表達(dá)的蛋白經(jīng)過充分的修飾加工，具有穩(wěn)定的生物活性。生物活性接近天然產(chǎn)品；⑷在動(dòng)物乳腺表達(dá)的外源基因可以遺傳，可用常規(guī)技術(shù)繁殖生產(chǎn)群體。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器研制2023/10/240轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器研制乳腺組織特異表的基因：具milk

box保守序列----乳清蛋白基因----β乳球蛋白基因----酪蛋白基因已開發(fā)的產(chǎn)物：----血栓治療藥物（組織型纖溶酶原激活因子)----出血性疾?。蜃覸III，IX）----免疫治療藥物（IFN，IL，TNF）----營養(yǎng)制劑(人乳鐵蛋白）2023/10/241人類疾病小鼠模型