正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化黃體酮緩釋栓的處方

正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化黃體酮緩釋栓的處方

由于合成激素的許多副作用，天然黃酮補(bǔ)充劑仍然是治療黃土不健康的最有效方法。已有相關(guān)報(bào)道尋求一些改進(jìn)的劑型和給藥途徑,如口服、肌內(nèi)注射、陰道給藥、鼻腔給藥、經(jīng)皮給藥和直腸給藥等。其中,黃體酮陰道栓因其吸收良好,給藥方便的特點(diǎn),在臨床上已廣泛應(yīng)用。但它存在著兩大缺點(diǎn),即血清孕酮水平低,維持時(shí)間短;而直腸栓經(jīng)吸收后約有50%～75%的藥物可不經(jīng)肝臟而直接進(jìn)入體循環(huán),可避免肝臟首過(guò)效應(yīng),從而減少給藥次數(shù);同時(shí)又克服了陰道栓吸收受黏性分泌物影響的缺點(diǎn)。為此,我們研制了黃體酮緩釋直腸栓。1儀器和藥品1.1s-133酶標(biāo)免疫分析法ZRS-8型智能溶出試驗(yàn)儀(天津大學(xué)無(wú)線電廠);UV751GD紫外分光光度計(jì)(上海分析儀器總廠);膠體磨(型號(hào)JMS-130,溫州市霸威食品機(jī)械有限公司);Serozyme-I型酶標(biāo)免疫分析儀(三波長(zhǎng)同時(shí)檢測(cè)492,550,630nm,程序編輯,曲線繪制微機(jī)處理機(jī),打印輸出);磁性分離器和振蕩器(深圳新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程有限公司);ProgesteroneSerozyme試劑盒(意大利BiochemImmunosystems,批號(hào)960600)。1.2黃體酮緩釋腸栓黃體酮(progesterone)原料藥(純度99.8%,湖北制藥廠,批號(hào)20000705);黃體酮緩釋直腸栓(testedformulation,規(guī)格50mg,黃體酮含量為標(biāo)示量的97.2%,自制);婦康寧栓(referenceformulation,上海醫(yī)工和益藥業(yè)有限公司,規(guī)格25mg,黃體酮含量為標(biāo)示量的96.4%,批號(hào)980301)。2制備工藝2.1處方的選擇2.1.1劑量及劑量的確定臨床上所使用的25mg普通栓劑已能提供治療濃度范圍的血清黃體酮水平,有報(bào)道建議栓劑劑量宜4～5倍于肌注量,并應(yīng)每12h給藥一次,本研究將含藥量定為一重要因素。采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法考察處方組成中基質(zhì)種類、阻滯劑卡波姆含量、含藥量等對(duì)緩釋栓體外釋放度的影響。各因素分別選用兩個(gè)水平,見(jiàn)表1。2.1.2peg-400研磨法因黃體酮具脂溶性,表2中四種處方的制備工藝,1與2同,用第一法;3與4同,用第二法。第一法:取PEG-4000和PEG-400的混合物(w/w=7∶3)加熱熔化(50～60℃),置膠體磨研磨,加入黃體酮、卡波姆后繼續(xù)研磨10min,灌模,待冷卻后起模即得。第二法:取脂溶性基質(zhì)36型混合脂肪酸甘油酯加熱熔化(50～60℃),加入黃體酮使溶解,置膠體磨中研磨,加入卡波姆后研磨10min,灌模,待冷卻后起模即得。2.1.3藥物動(dòng)力學(xué)檢測(cè)以下L4(23)安排實(shí)驗(yàn)。以釋放度作為指標(biāo),用“2.2”項(xiàng)所述方法進(jìn)行測(cè)定,擬尋找最優(yōu)處方作為受試制劑,與普通栓(參比制劑)作比較,并對(duì)其藥物動(dòng)力學(xué)進(jìn)行考察,觀察受試制劑是否具有緩釋特征。見(jiàn)表2。2.2外釋放率測(cè)定2.2.1波長(zhǎng)選擇根據(jù)主藥和輔料的紫外吸收?qǐng)D譜,選擇241nm為測(cè)定波長(zhǎng),輔料在此波長(zhǎng)處無(wú)吸收。2.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線方程用純化水配成濃度為5,10,15,20,25,30mg·L-1的黃體酮系列濃度的溶液,于波長(zhǎng)(241±1)nm分別測(cè)定吸收度A值,將A與C進(jìn)行線性回歸,得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:C(mg·L-1)=0.0481X+0.0117(n=6,r=0.999),線性范圍在5～30mg·L-1。2.2.3供試品溶液的制備本試驗(yàn)采用對(duì)照品法,參照中國(guó)藥典2000年版二部轉(zhuǎn)籃法進(jìn)行體外溶出試驗(yàn),具體操作如下:溶出遞質(zhì)為濃度5‰十二烷基硫酸鈉溶液,溫度37℃,轉(zhuǎn)速100r·min-1,于系列時(shí)間點(diǎn)精密量取樣液5mL,濾過(guò),同時(shí)補(bǔ)充等量同溫遞質(zhì)。取續(xù)濾液2mL置10mL量瓶中,加溶出遞質(zhì)稀釋至刻度,即得供試品溶液。同前法分別測(cè)定供試液和對(duì)照品溶液的A值,通過(guò)對(duì)照法計(jì)算得供試品溶液濃度。2.3加樣制劑選擇參照中國(guó)藥典2000年版中附錄XIXD有關(guān)規(guī)定,緩釋制劑末端取樣點(diǎn)釋放量要求75%以上,才能說(shuō)明釋藥基本完全。從表2可見(jiàn),最優(yōu)處方為A1B1C1,恰好與處方1相同,因此選擇處方1作為受試制劑。受試制劑處方:黃體酮5g,卡波姆1.45g,PEG-400098g,PEG-40042g,按“2.1.2”項(xiàng)下方法操作,共制成100粒。參比制劑15min、30min和1h黃體酮累積釋放度分別為27%～36%,57%～66%,96%～99%;受試制劑1,2,8h黃體酮累積釋放度分別為51%～57%,66%～71%,91%～96%。與參比制劑相比,受試制劑有明顯的緩釋特征,其體外溶出累積百分率Fr對(duì)時(shí)間t作圖,所得Fr-t曲線見(jiàn)圖1。3生物樣品分析的建立3.1檢測(cè)血酸酯類抗體樣品的制備(1)洗滌液由14.3mL用去離子水稀釋至200mL,配成應(yīng)用洗滌液。(2)標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控和標(biāo)本各加60μL,然后加堿性磷酸酶標(biāo)抗原30μL,加熒光素標(biāo)抗體30μL,混勻后置37℃水浴孵育15min。(3)加連有磁微粒的抗熒光素抗體60μL,混勻后置37℃水浴孵育10min,于磁分離器上分離4min后,倒去上清。(4)加洗滌液300μL,混勻后置磁分離器上分離4min,去上清液。依法重復(fù)操作一次。(5)加底物磷酸酚酞90μL,另外準(zhǔn)備一只試管只加底物作空白管,混勻,37℃水浴孵育10min。(6)加入終止液300μL(含空白管),混勻后置上磁分離器分離,10min后比色(空白管調(diào)零)。3.2測(cè)定的確證3.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸濃度為0,0.5,1.0,5.0,10,40μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)液依上法操作所得吸光度(A)經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后,對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸,得回歸方程為:Y=-0.0199X-0.0933(r=0.998,n=6)。3.2.2靈敏度和檢出限以兔血清樣品為研究對(duì)象。由于該方法為競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫反應(yīng),待測(cè)樣品藥物含量越低,顯色越好,因此該方法有靈敏度高的顯著特點(diǎn),最低檢測(cè)限接近于0。3.2.3黃體酮標(biāo)準(zhǔn)液的測(cè)定同時(shí)將濃度為2.5,10.0,40.0μg·L-1的黃體酮標(biāo)準(zhǔn)液,以吸收度A為指標(biāo),測(cè)定日內(nèi)和日間變異。結(jié)果表明:日內(nèi)RSD為3.3%～7.1%(n=5),日間RSD為4.0%～9.1%(n=5)。3.2.4回收實(shí)驗(yàn)檢測(cè)配制終濃度為2.5,10.0,40.0μg·L-1的黃體酮標(biāo)準(zhǔn)液,進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。結(jié)果表明:相對(duì)回收率為93.7%～100.4%。4藥房與動(dòng)態(tài)研究4.1血藥濃度檢測(cè)按隨機(jī)交叉的原則將6只家兔分為2組,分別給予2.75mg·kg-1的受試制劑與參比制劑,隔一定時(shí)間耳緣靜脈取血,按上述“3.1”項(xiàng)下操作方法測(cè)得兩制劑的血藥濃度。血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖2。從血藥濃度-時(shí)間曲線可看出:直腸給藥給予兩種制劑后,藥物吸收很快,血中5min即可檢測(cè)到藥物,特征與靜脈給藥十分類似。受試制劑達(dá)峰時(shí)間略遲于參比制劑;受試制劑峰濃度明顯低于參比制劑,但下降速度較慢,具有緩釋特征。4.2藥動(dòng)學(xué)參數(shù)分析所得血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)分別用3P97程序進(jìn)行擬合,采用Aikaike(AIC)信息標(biāo)準(zhǔn)為擬合度指標(biāo)進(jìn)行判斷。結(jié)果表明,受試制劑體內(nèi)過(guò)程具有二房室一級(jí)動(dòng)力學(xué)特征。Cmax、t1/2、tpeak和AUC0-24h等藥動(dòng)學(xué)參數(shù)參照中國(guó)藥典2000年版二部,采用非房室模型法進(jìn)行處理,其中:Cmax、tmax為實(shí)測(cè)值,t1/2按0.693/z求出。z是末端消除速度常數(shù),用對(duì)數(shù)血藥濃度-時(shí)間曲線末端直線部分斜率求得。結(jié)果見(jiàn)表3。4.3生物利用用梯形法求得兩制劑的血藥濃度-時(shí)間曲線下面積(AUC),數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。緩釋栓的相對(duì)生物利用度為110.2%。4.4生物等效性檢驗(yàn)將Cmax和AUC0-tn經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行方差分析和雙單側(cè)t檢驗(yàn),tpeak進(jìn)行非參數(shù)秩和檢驗(yàn),方差分析結(jié)果為:單次給藥后,受試制劑與參比制劑間差異無(wú)顯著性(P>0.05);雙單側(cè)t檢驗(yàn)結(jié)果為:兩制劑Cmax不具生物等效性,AUC0-tn具有生物等效性。由于受試制劑為緩釋制劑,而參比制劑為普通制劑,二者吸收程度生物等效,Cmax有所降低,tpeak有所延長(zhǎng),這與4.1中釋藥特征相符和,從而進(jìn)一步說(shuō)明受試制劑有緩釋特征。5討論5.1降低釋放百分率正交實(shí)驗(yàn)中可以看出:采用脂溶性基質(zhì)的處方8h后累積釋放百分率都很低(<20%),脂溶性較大的藥物混懸在水溶性基質(zhì)中,能降低藥物在基質(zhì)中的殘留量,獲得較完全的釋放與吸收。黃體酮脂溶性大,以選擇水溶性基質(zhì)為宜。5.2表達(dá)總蛋白t-pcr活性測(cè)定磁性分離酶聯(lián)免疫分析法是將競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)與磁性微粒分離技術(shù)相結(jié)合的一種測(cè)定法。用ALT標(biāo)記的抗原(衍生物)和標(biāo)本抗原(P)競(jìng)爭(zhēng)性的與異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的P抗體結(jié)合,形成酶標(biāo)抗原-FITC標(biāo)記抗體的復(fù)合物,再加入磁性分離劑(含有與抗FITC結(jié)合的磁性微粒),使復(fù)合物與磁性微粒結(jié)合,在永久磁鐵吸引下,使其沉淀至管底。分離堿性磷酸酶標(biāo)抗原,加入底物磷酸酚酞PMP,ALT催化PMP水解釋放出酚酞,在pH10.5的緩沖液(終止液)中呈粉紅色,再以永久磁鐵吸引磁性復(fù)合物使其沉淀,上清液置Serozyme-I型酶標(biāo)免疫分析儀測(cè)定吸收度A值。由于標(biāo)本中待測(cè)物與酶標(biāo)記物都是抗原,而成色與酶標(biāo)抗原量成正比,因此與標(biāo)本量成反比。5.3磁酶免疫分析技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)與酶聯(lián)免疫法相比,分離完全而快速;與放免法相比,避免了放射性物質(zhì)污染;與色譜法相比,靈敏度高,無(wú)需預(yù)處理等優(yōu)點(diǎn)。5.4抗酶反應(yīng)中的抗酶反應(yīng)兔與人黃體酮抗原決定族不同,種屬之間無(wú)交叉抗原-抗體免疫反應(yīng)。而小鼠與人黃體酮抗原決定族相同,因而有免疫反應(yīng)發(fā)生。5.