抗腫瘤藥物篩選

抗腫瘤藥物篩選1整理課件抗腫瘤藥物篩選

是新藥發(fā)現(xiàn)與開發(fā)的重要環(huán)節(jié).通常是指從樣品到活性檢測(cè)至動(dòng)物實(shí)驗(yàn)療效各個(gè)階段的工作.一般常用以下幾種方法:1.腫瘤細(xì)胞組織培養(yǎng)篩選方法2.微生物學(xué)篩選方法Antitumordurgscreening。2整理課件1.腫瘤組織細(xì)胞培養(yǎng)篩選方法細(xì)胞培養(yǎng)法是篩選抗腫瘤藥物比較常用的一種方法.它包括人體腫瘤細(xì)胞和動(dòng)物腫瘤細(xì)胞,培養(yǎng)方法包括單層細(xì)胞培養(yǎng)、瓊脂平板培養(yǎng)、細(xì)胞集落培養(yǎng)、組織塊培養(yǎng)、器官培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)等.觀察藥物活性的方法包括細(xì)胞形態(tài)、分裂相計(jì)數(shù)、脫氫酶活性、細(xì)胞染色、呼吸測(cè)定、熒光顯微鏡下染色反響、核酸蛋白質(zhì)等生化測(cè)定以及同位素技術(shù)等.3整理課件當(dāng)前,體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)選用人癌細(xì)胞株,按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng),使用四氮唑藍(lán)(MTT)復(fù)原法,磺羅丹明B染色法或集落形成法等測(cè)定藥物抗癌作用.本實(shí)驗(yàn)除了用于抗腫瘤藥物的初步篩選外,還用于了解候選化合物的抗瘤譜,為隨后進(jìn)行體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)(如劑量范圍.腫瘤類別等)提供參考.4整理課件2.微生物學(xué)篩選方法盡管利用癌細(xì)胞體外培養(yǎng)作為抗腫瘤藥物的篩選模型要比利用微生物模型篩選出的體內(nèi)有效的抗腫瘤藥物的命中率更大,但基于微生物生長(zhǎng)與動(dòng)物細(xì)胞代謝有這不少共同點(diǎn),加上微生物學(xué)方法簡(jiǎn)便,適合大量天然產(chǎn)物的初篩,因此,微生物學(xué)方法一直為國(guó)內(nèi)外試驗(yàn)室所采用.5整理課件噬箘體法噬菌體(bacteriophage,phage)是感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒的總稱，因局部能引起宿主菌的裂解，故稱為噬菌體。本世紀(jì)初在葡萄球菌和志賀菌中首先發(fā)現(xiàn)。噬菌體具有病毒的一些特性：個(gè)體微小。噬菌體基因組含有許多個(gè)基因，但所有的噬菌體都是細(xì)菌細(xì)胞中利用細(xì)菌的核糖體、蛋白質(zhì)合成時(shí)所需的各種因子、各種氨基酸和能量產(chǎn)生系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)其自身的生長(zhǎng)和增殖。一旦離開了宿主細(xì)胞，噬菌體既不能生長(zhǎng)，也不能復(fù)制。

6整理課件7整理課件噬箘體8整理課件噬箘體的兩種類型噬菌體有毒〔烈〕性噬菌體和溫和噬菌體兩種類型。侵入宿主細(xì)胞后，隨即引起宿主細(xì)胞裂解的噬菌體稱作毒性噬菌體。毒性噬菌體被看作正常表現(xiàn)的噬菌體。溫和噬菌體那么是：當(dāng)它侵入宿主細(xì)胞后，其核酸附著并整合在宿主染色體上，和宿主核算同步復(fù)制，宿主細(xì)胞不裂解而繼續(xù)生長(zhǎng)。這種不引起宿主細(xì)胞裂解的噬菌體稱作溫和噬菌體.也即溶原性細(xì)菌.9整理課件★噬箘體法包括抗噬箘體法和溶原性菌誘導(dǎo)法兩種.細(xì)菌的噬箘體核酸大局部為雙鏈DNA,干擾DNA代謝的抗生素(如放線菌素.博來霉素)常也抑制噬箘體在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng),從而出現(xiàn)抗噬箘表達(dá)象.T4噬箘體吸附在大腸桿菌細(xì)胞10整理課件11整理課件應(yīng)用誘導(dǎo)溶源性菌前噬箘體的方法篩選.溶源性菌的噬箘體DNA基因組直接螯合到細(xì)菌染色體DNA,不復(fù)制,因?yàn)榇缶植炕蚬δ苁盏搅恕白瓒粑铷曇种?但當(dāng)活性“阻遏物〞的量由于細(xì)胞內(nèi)或環(huán)境因子(物理的化學(xué)的)而降低時(shí),溶源性就不能維持,前噬箘體就與染色體離開,進(jìn)入自己的生長(zhǎng)周期,又產(chǎn)生成熟的具感染性的噬箘體使細(xì)胞裂解,這種現(xiàn)象即為誘導(dǎo)作用.12整理課件★細(xì)菌變種法利用細(xì)菌為材料來篩選抗腫瘤抗生素主要有兩種方法.一類是人工培養(yǎng)變種,使細(xì)菌有一定的代謝特征.如使細(xì)菌糖酵解代謝增強(qiáng)等,或誘變生化變株,使細(xì)菌模仿腫瘤細(xì)胞的某種代謝特點(diǎn)或者使其對(duì)核酸或蛋白質(zhì)合成的抑制劑有高度的敏感性.另一類是檢測(cè)突變作用,由于抗腫瘤藥物能使某些微生物產(chǎn)生突變作用,例如用依賴鏈霉素菌株來篩選藥物,如果使依賴鏈霉素菌株誘變?yōu)椴灰蕾囨溍顾?那么就有可能具有抗腫瘤作用.13整理課件★抗代謝法抗代謝物在含無(wú)機(jī)氮源的合成培養(yǎng)基中顯示抗癌作用,而在普通有機(jī)氮源的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中無(wú)抗癌作用.利用這個(gè)特點(diǎn),選擇無(wú)機(jī)氮源實(shí)驗(yàn)有抗菌作用的物質(zhì),作為抗代謝的初篩方法.14整理課件★精原細(xì)胞法1.建立精原細(xì)胞法的依據(jù)造精過程可分為以下階段:A型精原細(xì)胞、B型精原細(xì)胞、靜止期初級(jí)精母細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞(細(xì)線期.偶線期.粗線期.雙線期.終變期)、次級(jí)精母細(xì)胞、精子細(xì)胞(園核精子細(xì)胞.長(zhǎng)核精子細(xì)胞)、精子.在造精細(xì)胞系列中,對(duì)放射最為敏感的是B型精原細(xì)胞,其次是A型精原細(xì)胞,然后依次為精子細(xì)胞、精母細(xì)胞、精子.15整理課件精原細(xì)胞法陽(yáng)性和抗腫瘤作用的相關(guān)性尤以在抗生素和植物藥中較為明顯.用精原細(xì)胞法檢測(cè)72種抗生素,精原細(xì)胞法陽(yáng)性的13種抗生素,據(jù)已報(bào)道資料均屬抗腫瘤抗生素,其中9種在臨床上有一定療效.精原細(xì)胞法陰性的59種抗生素中,除又霉素、滅胞素、環(huán)己烯亞胺、螺旋霉素?fù)?jù)報(bào)道在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有抗腫瘤活性外,其他55種均未見報(bào)道有抗腫瘤作用.在陰性的59種中,全部未見報(bào)道對(duì)腫瘤有臨床療效.說明精原細(xì)胞法檢測(cè)結(jié)果與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)抗腫瘤作用有較好的相關(guān)性.16整理課件抗腫瘤藥物篩選的分子靶點(diǎn)、當(dāng)前用于抗腫瘤藥物篩選的靶點(diǎn)種類繁多.主要有細(xì)胞周期調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞死亡通路、耐藥性侵襲轉(zhuǎn)移、血管生成等.1.抑制血管生成的篩選模型★在腫瘤發(fā)生的過程中,當(dāng)腫瘤的體積超過0.2-2.0mm時(shí),開始建立自己的血液供給系統(tǒng),即血管生成,為腫瘤的生長(zhǎng)提供物質(zhì)根底.腫瘤新生血管的滋養(yǎng)作用可為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng).氧氣和代謝交換等.而血管內(nèi)皮細(xì)胞可通過旁分泌作用產(chǎn)生各種生長(zhǎng)因子和刺激因子,如血小板源生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子、以及細(xì)胞因子白介素-6.白介素-8等.這些因子能夠誘導(dǎo)刺激腫瘤增殖和遷移.而且,腫瘤細(xì)胞與毛細(xì)血管形成結(jié)構(gòu)上的密切關(guān)系.此外,腫瘤細(xì)胞和血管細(xì)胞具有相互作用.一方面血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的各種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子對(duì)腫瘤生長(zhǎng)起到生長(zhǎng)刺激作用;另一方面,腫瘤細(xì)胞可分泌血管內(nèi)皮細(xì)胞生存和增殖所需的有絲分裂原和動(dòng)力原等.17整理課件★抑制血管生成藥物的篩選方法如上所述,血管生成與腫瘤有著密切的聯(lián)系,因此近年來幾種體內(nèi)和體外的分析系統(tǒng)已被用于篩選抑制血管生成藥物.體外分析系統(tǒng)包括血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)、血管內(nèi)皮細(xì)胞在膠原基質(zhì)上的遷移、血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外損傷效應(yīng)和凋亡分析等.目前,腫瘤血管生成體內(nèi)研究的生物試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭饕袆?dòng)物(大鼠,兔等)、眼角膜囊(眼前房)、地鼠頰囊、裸鼠外耳皮下和雞胚絨毛尿囊膜等四種動(dòng)物模型.18整理課件★以端粒酶為靶點(diǎn)的藥物篩選癌細(xì)胞的永生化是腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵.腫瘤細(xì)胞內(nèi)的端粒.端粒酶與此特征有非常重要的關(guān)系.研究資料說明,端粒酶幾乎在人類惡性腫瘤中有不同程度的高表達(dá),其活性檢出率為85﹪-95﹪,而腫瘤周圍的正常組織及良性病變中的檢出率僅為4﹪.而且端粒酶活性與腫瘤的惡性程度,腫瘤的大小,淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移,腫瘤的分級(jí)和預(yù)後密切相關(guān).目前,普遍認(rèn)為端粒酶是一種新的.很有價(jià)值的腫瘤標(biāo)志物.因此,端粒酶已成為抗腫瘤藥物篩選的新靶點(diǎn).19整理課件端粒和端粒酶端粒是真核細(xì)胞線性染色體末端的一種特殊結(jié)構(gòu),由一段富含鳥嘌呤(G)的DNA串聯(lián)重復(fù)序列及相關(guān)蛋白質(zhì)組成.具有高度保守性的端粒能夠保護(hù)染色體末端免于化學(xué)修飾或被核酶降解,防治染色體復(fù)制時(shí)末端粒的長(zhǎng)度決定細(xì)胞的壽命,隨著細(xì)胞分裂的進(jìn)行,端粒的長(zhǎng)度逐漸縮短,當(dāng)端?？s短到一定程度即不能維持染色體的穩(wěn)定時(shí),細(xì)胞最終死亡.故有人稱端粒為〞生命的時(shí)鐘〞或〞有絲分裂的計(jì)數(shù)器〞.而大多數(shù)腫瘤的端粒長(zhǎng)度不隨細(xì)胞分裂次數(shù)增加而縮短,具有無(wú)限分裂的能力,其原因在于端粒酶的存在.20整理課件

端粒酶是一種端粒酶能以自身的RNA為模板,逆轉(zhuǎn)錄合成端粒DNA序列添加到染色體末端,以補(bǔ)償細(xì)胞分裂時(shí)端粒DNA的縮短,使細(xì)胞克服危機(jī)期,成為永生細(xì)胞.RNA依賴的

DNA聚合酶,屬于核酸蛋白質(zhì)復(fù)合物,由RNA和蛋白質(zhì)兩種組分構(gòu)成.大多數(shù)體細(xì)胞,端粒酶呈非激活狀態(tài).而大多數(shù)腫瘤細(xì)胞,端粒酶呈激活狀態(tài).21整理課件以端粒酶為靶點(diǎn)篩選的藥物

按藥物作用機(jī)制可分為直接以端粒酶核心組分(RNA局部和催化亞基)為靶標(biāo)的藥物、以端粒的DNA為靶標(biāo)的藥物、以端粒和端粒酶蛋白質(zhì)組分為靶標(biāo)的藥物等.如:通過端粒重復(fù)擴(kuò)增法證實(shí)玉紅霉素及其類似物能抑制人端粒酶活性.如:茶葉中兒茶酚能夠直接強(qiáng)烈地抑制端粒酶活性.22整理課件★細(xì)胞凋亡通路的靶點(diǎn)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡必要的信號(hào)分子是一類絲氨酸蛋白酶,稱為Caspases家族.該家族共有十多個(gè)成員,可以彼此之間互相活化形成級(jí)聯(lián)反響.Caspasea活化有多種途徑.1細(xì)胞膜通路,是由腫瘤壞死因子(TNF)受體家族介導(dǎo)2線粒體通路,由線粒體誘導(dǎo)凋亡,主要靠釋放細(xì)胞色素C實(shí)現(xiàn).后者可形成活化Caspases的多蛋白復(fù)合體.23整理課件★有關(guān)細(xì)胞周期調(diào)控的靶點(diǎn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的根本特征是細(xì)胞失控增殖,其細(xì)胞周期及關(guān)卡調(diào)控失常,故細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶和關(guān)卡激酶可能作為抗腫瘤藥物的靶點(diǎn).24整理課件★與侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的靶點(diǎn)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成有關(guān).正常情況下,MMP受到內(nèi)源性物質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物(TIMP)嚴(yán)格控制.但在腫瘤那么出現(xiàn)MMP與TIMP的平衡失控.高侵襲轉(zhuǎn)移的腫瘤通常伴有MMP含量與活性的升高.MMP不僅由腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生,同時(shí)也由反響的間質(zhì)細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、炎癥細(xì)胞產(chǎn)生.以MMP為靶點(diǎn)的藥物,其作用點(diǎn)不僅在于腫瘤細(xì)胞,也在于腫瘤部位的反映性間質(zhì)細(xì)胞.近年來,小分子的MMP抑制劑已進(jìn)入臨床研究.25整理課件抗腫瘤藥物篩選研究趨向分子生物學(xué)、分子藥理學(xué)與分子治療學(xué)的研究進(jìn)展推動(dòng)了分子靶向藥物的研制和臨床對(duì)靶向藥物療效的評(píng)價(jià),使得我們可以從以下方面進(jìn)行研究:1.藥物來源的多樣性.如化學(xué)合成的化合物、微生物、植物、海洋生物來源物質(zhì)及生物制品等.2.藥物靶點(diǎn)的多樣性.既利用直接與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)的分子靶點(diǎn),也利用與腫瘤微環(huán)境相關(guān)的分子靶點(diǎn).利用多種多樣的分子靶點(diǎn),將可能發(fā)現(xiàn)具有各種分子作用機(jī)制的藥