濁點(diǎn)萃取液-液萃取方法的研究進(jìn)展

濁點(diǎn)萃取液-液萃取方法的研究進(jìn)展

一、高效液相色譜前處理云萃取方法（cpe）是近年來(lái)提出的一種新興的液相萃取技術(shù)。使用具有機(jī)械溶劑不會(huì)影響環(huán)境。它以中性表面活性劑膠束水溶液的溶解性和濁點(diǎn)現(xiàn)象為基礎(chǔ),改變實(shí)驗(yàn)參數(shù)引發(fā)相分離,將疏水性物質(zhì)與親水性物質(zhì)分離。目前,該法已成功地應(yīng)用于金屬螯合物、生物大分子的分離與純化及環(huán)境樣品的前處理中。它經(jīng)濟(jì)、安全、高效、操作簡(jiǎn)便、應(yīng)用范圍廣。作為分離純化方法,易于大規(guī)模生產(chǎn);作為樣品前處理方法可與高效液相色譜(HPLC)、流動(dòng)注射分析(FIA)等后序儀器分析方法聯(lián)用。本文概述了CPE的原理、操作方法,總結(jié)了CPE近年來(lái)在生物大分子的分離及分析方面的應(yīng)用,討論了與其他液-液萃取法的區(qū)別,還探討了該法的發(fā)展前景。二、濁點(diǎn)提取的基礎(chǔ)1.濁點(diǎn)現(xiàn)象—表面活性劑膠束溶液的形成和濁點(diǎn)現(xiàn)象表面活性劑分子通常由疏水和親水兩部分組成。疏水部分在水溶液中聚集成核,親水部分向外張開(kāi)形成膠束。表面活性劑在水溶液中形成膠束的最小濃度稱為臨界膠束濃度(CMC),最低溫度稱為臨界膠束溫度(CMT)。表面活性劑類型不同,溶液條件不同,膠束形態(tài)各異,如圓形、橢圓形、圓柱形。平時(shí)應(yīng)用表面活性劑性質(zhì)最多的是它的增溶作用,很多微溶于水或不溶于水的物質(zhì)可以與表面活性劑結(jié)合后溶于水。CPE法除了利用增溶作用外,還利用了表面活性劑另一個(gè)重要性質(zhì)——濁點(diǎn)現(xiàn)象。一個(gè)均一的表面活性劑水溶液在外界條件(如溫度)變化時(shí),因?yàn)橐l(fā)相分離而突然出現(xiàn)渾濁的現(xiàn)象叫濁點(diǎn)現(xiàn)象,此時(shí)的溫度叫做濁點(diǎn)溫度(CP)。靜置一段時(shí)間(或離心)后會(huì)形成兩個(gè)透明的液相:一為表面活性劑相(約占總體積的5%);另一為水相(膠束濃度等于CMC)。外界條件(如溫度)向相反方向變化,兩相便消失,再次成為均一溶液。溶解在溶液中的疏水性物質(zhì)如膜蛋白,與表面活性劑的疏水基團(tuán)結(jié)合,被萃取進(jìn)表面活性劑相,親水性物質(zhì)留在水相,這種利用濁點(diǎn)現(xiàn)象使樣品中疏水性物質(zhì)與親水性物質(zhì)分離的萃取方法就是濁點(diǎn)萃取。圖1顯示了由溫度變化引發(fā)的這種相分離現(xiàn)象。溫度的改變,引起水化層的破壞,增強(qiáng)了表面活性劑的疏水性。相分離是熵(傾向于水與膠束相溶)與焓(傾向于水與膠束相分離)競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果。濁點(diǎn)萃取中表示表面活性劑膠束溶液濃度與濁點(diǎn)溫度變化關(guān)系的相圖,對(duì)不同體系其形狀各不相同。相圖上的曲線也是其兩相的共溶曲線。圖2A為非離子型表面活性劑膠束溶液的相圖,溫度-濃度曲線把圖分為兩部分,上部為雙相區(qū)(2L),下部為單相區(qū)(L)。曲線的最低點(diǎn)對(duì)應(yīng)的濃度與溫度分別為表面活性劑的CMC和CMT。圖2B為兩性離子表面活性劑膠束溶液的相圖,溫度-濃度曲線同樣把相圖分為兩個(gè)區(qū)域。不同的是上部為L(zhǎng)下部為2L。這就意味著溫度升高兩相消失,溫度降低至濁點(diǎn)以下,兩相又出現(xiàn)。與非離子型表面活性劑恰好相反,兩相的出現(xiàn)是由于溫度下降而不是溫度升高引發(fā)的。2.其他表面活性劑研究影響濁點(diǎn)萃取常用的參數(shù)包括:表面活性劑的濁點(diǎn)(CP)、萃取率(E)、濃縮因子(CF)和分配系數(shù)(K)。它們可用下式表示:E=CS×VS/(CO×VO)=CF×VS/VO;CF=CS/CO;K=CS/CW。其中CS為溶質(zhì)在表面活性劑中的濃度,CO為萃取平衡后溶質(zhì)在原始溶液中的濃度,CW為溶質(zhì)在水相中的濃度,VS為表面活性劑的體積,VO為原始溶液的體積。影響濁點(diǎn)萃取的因素很多,簡(jiǎn)要概括如下:(1)表面活性劑類型及性質(zhì)選擇表面活性劑時(shí)主要考慮其兩個(gè)性質(zhì):①濁點(diǎn)溫度,尤其對(duì)于熱敏感的分析物要注意操作溫度對(duì)穩(wěn)定性的影響;②疏水性,疏水性太強(qiáng)會(huì)造成蛋白質(zhì)失活。表1中列出了CPE中常用的表面活性劑名稱、結(jié)構(gòu)和濁點(diǎn)溫度以及它們的臨界膠束參數(shù)。濁點(diǎn)溫度與表面活性劑中親水、疏水鏈長(zhǎng)有關(guān)。疏水部分相同時(shí),親水鏈長(zhǎng)增加,CP升高;相反,疏水鏈長(zhǎng)增加,CP下降。表面活性劑濃度增加,E隨之增加達(dá)到最大值。(2)添加劑的加入在生物大分子的濁點(diǎn)萃取中,特別是對(duì)熱敏感的生物大分子,需要使用CP較低、疏水性適宜的表面活性劑。很多添加劑如電解質(zhì)、有機(jī)物、表面活性劑、蛋白質(zhì)變性劑等都可在很大范圍內(nèi)影響表面活性劑的CP,引發(fā)表面活性劑水溶液的相分離?？梢约尤氲碾娊赓|(zhì)種類很多。在非離子型表面活性劑中加入氯化物、硫酸鹽、碳酸鹽、疊氮化物等鹽析型電解質(zhì),可使膠束中氫鍵斷裂脫水,導(dǎo)致表面活性劑分子沉淀從而降低表面活性劑的CP,引發(fā)相分離。引發(fā)相分離的鹽濃度與表面活性劑的疏水性有關(guān),疏水性強(qiáng)需要的鹽濃度低。在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)中要加入NaCl,一方面降低CP溫度,另外縮短相分離時(shí)間。鹽濃度增加可以使E和CF提高,但要避免過(guò)高鹽濃度以免對(duì)酶產(chǎn)生抑制作用。但加入硝酸鹽、碘化物、硫氰酸鹽等鹽溶型電解質(zhì),作用相反,可以使CP升高。離子強(qiáng)度對(duì)E、K、相體積無(wú)明顯影響,但是離子強(qiáng)度可以改變水相密度,便于兩相分離。與水完全混溶的極性有機(jī)物如脂肪醇、脂肪酸、苯酚能使非離子型表面活性劑的CP降低。多元醇如葡萄糖、蔗糖、丙三醇,水溶性聚合物如聚乙二醇(PEG)、環(huán)糊精,也可以降低CP;聚合物使CP降低的效果既與濃度有關(guān),也與分子量有關(guān)。丙三醇、蔗糖經(jīng)常用于穩(wěn)定蛋白質(zhì),可用來(lái)防止不穩(wěn)定蛋白質(zhì)的變性。Werck-Reichhart等在從植物微粒體中萃取細(xì)胞色素b5和P450中加入丙三醇降低了表面活性劑的CP。短鏈飽和烴類降低CP不太顯著,而更多的可溶于膠束的非極性有機(jī)物使CP升高。蛋白質(zhì)變性劑(尿素、硫脲衍生物等)使CP升高。陰離子型表面活性劑和其它水溶助劑(hydrotrope,如甲苯磺酸鈉),也使CP升高。對(duì)于兩性型表面活性劑,添加劑的作用與非離子型表面活性劑的情況完全相反。(3)混合型表面活性劑使用混合表面活性劑也可以在一定范圍內(nèi)控制濁點(diǎn)溫度。如TritonX-114/TritonX-45,可以在0—22℃內(nèi)根據(jù)表面活性劑比例不同而任意調(diào)節(jié)CP。它們的關(guān)系可用下式表示:CP(℃)=21.4-1.23w(w為T(mén)ritonX-45的質(zhì)量百分含量)。Minuth等報(bào)道了使用混合型表面活性劑代替純的C12E5表面活性劑萃取膽固醇氧化酶(CHO)。使用氧乙烯基團(tuán)窄分布的聚氧乙烯表面活性劑混合物C12E5/C14E6、C14E5/C14E6、C12-18E5,得到較好的萃取率且降低了成本;而氧乙烯基團(tuán)寬分布的聚氧乙烯表面活性劑混合物C12E4/C14E4、C12E5/C14E5、C12-18E5的CP過(guò)高,難以引發(fā)相分離。Chiang等分別用C12E4/C12E5和C14E5/C14E6混合表面活性劑CPE分離膽固醇脂酶。他們還分別計(jì)算出CP與混合物中短氧乙烯基的表面活性劑質(zhì)量百分比的關(guān)系為CP(℃)=20.75-0.309w和CP(℃)=32.82-0.243w。(4)pH的影響pH是影響生物大分子性質(zhì)的重要參數(shù)之一。在等電點(diǎn)附近時(shí),蛋白質(zhì)的疏水性最強(qiáng),最適合于進(jìn)行濁點(diǎn)萃取,而且得到的E、K也是最大。偏離等電點(diǎn)后,疏水性減小,萃取過(guò)程的E、K都隨之下降。3.膠束與水溶液蛋白質(zhì)的相互作用Blankschtein等人在研究CPE過(guò)程中,發(fā)現(xiàn)親水性蛋白質(zhì)的K<1,而在通常的CPE中,被萃取物的K>>1。他們提出了親水性蛋白質(zhì)與膠束的體積排阻理論。發(fā)現(xiàn)非離子型表面活性劑(C10E4)在水溶液中自聚成圓柱形膠束,形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),網(wǎng)眼大小遠(yuǎn)大于蛋白質(zhì)。膠束與水溶性球蛋白的相互作用如同兩個(gè)互不締合的實(shí)體發(fā)生近距離排斥和體積排阻的作用。該作用與蛋白的大小、形狀有關(guān)。典型的親水性球蛋白的半徑在1.5—5nm間,它們的分配系數(shù)在0.85—0.4之間,相分離后親水性球蛋白留在水相。他們應(yīng)用該理論預(yù)測(cè)了大小不同的幾種親水性蛋白質(zhì)(細(xì)胞色素c、大豆胰蛋白酶抑制劑、卵清蛋白、牛血清白蛋白、過(guò)氧化氫酶)分別在C10E4膠束及C8-lecithin膠束中的分配系數(shù),預(yù)測(cè)的分配系數(shù)與實(shí)驗(yàn)值吻合。作者還預(yù)測(cè)了幾種病毒:噬菌體ΦX174,P22,T4在C10E4膠束中的分配系數(shù),比實(shí)驗(yàn)值略大。4.peo-ppo嵌段基層聚合物的分離和分離CPE法與雙水相體系類似,都可以用于生物大分子、有機(jī)物及金屬離子的萃取。雙水相體系通常使用PEG/葡聚糖或PEG/鹽體系,但前者原料價(jià)格昂貴,后者對(duì)于兩親性蛋白質(zhì)溶解性較差,使蛋白易留在水相。相分離后聚合物與蛋白質(zhì)也較難分離。而CPE法表面活性劑用量較少,價(jià)格便宜,體系組成簡(jiǎn)單,并且表面活性劑與蛋白質(zhì)容易分離,便于回收再利用。由PEO-PPO嵌段共聚物(如pluronic)或EO-PO無(wú)規(guī)共聚物(如UCON)組成的液-液萃取系統(tǒng)與中性表面活性劑的CPE法也十分類似。共聚物溶液也是在升溫至CP點(diǎn)后相分離,PEO-PPO嵌段共聚物也形成膠束溶液再分相,并且它可以先與羥丙基淀粉或葡聚糖組成雙水相系統(tǒng),分離后共聚物相升溫至CP再次相分離。該體系也可用于生物大分子的分離。有的學(xué)者認(rèn)為它屬于CPE發(fā)展的一個(gè)新方向;另一些學(xué)者認(rèn)為它自成一個(gè)體系稱之為熱分離聚合物體系(TPS),在此不作詳細(xì)討論。三、表面活性劑相的設(shè)置Bordial最早將CPE應(yīng)用于生物學(xué)領(lǐng)域,其操作步驟較簡(jiǎn)單,無(wú)需使用專門(mén)儀器。密度不同,表面活性劑相對(duì)水相的位置也不同。表面活性劑相通常為液態(tài),且粘度較大(η≈20cP)。所以,有時(shí)要在表面活性劑相中加入少量的溶劑來(lái)稀釋它,而且可用表面活性劑多次萃取水相。此后,很多人對(duì)這種基本操作法做了修正,如用蔗糖溶液作為緩沖物分隔表面活性劑相與水相;低溫下(-20℃)將樣品與表面活性劑培養(yǎng)24h,使疏水性極強(qiáng)的蛋白質(zhì)沉淀。1.高效液相萃取法CPE法可用于分離膜蛋白、酶、動(dòng)物、植物和細(xì)菌的受體,還可以替代一些分離方法如硫酸銨分級(jí)法作為純化蛋白的第一步,與色譜方法聯(lián)用。另外,CPE法分離純化蛋白質(zhì)已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模操作。Minuth等人成功地進(jìn)行了膽固醇氧化酶濁點(diǎn)萃取的中試研究。雖然他們的方法耗時(shí)較長(zhǎng)(約20h),但是投資少、勞動(dòng)強(qiáng)度低,萃取效率及濃縮因子與實(shí)驗(yàn)室制備結(jié)果類似。使用離心分離器可以使CPE大規(guī)模連續(xù)進(jìn)行。但商品離心分離器用于CPE的效率和容量仍需進(jìn)一步研究。另外,他們發(fā)現(xiàn)相分離操作受細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生的表面活性物質(zhì)影響較大。還有,體系兩相間密度差較小,表面張力較小,含產(chǎn)物的表面活性劑相的流變學(xué)行為較復(fù)雜,操作較難。表2列出了CPE法近幾年來(lái)在蛋白質(zhì)分離純化中的應(yīng)用。(1)膜蛋白的分離純化膜蛋白(內(nèi)嵌膜蛋白、外圍膜蛋白)疏水性強(qiáng)、難溶于水,抽提內(nèi)嵌膜蛋白時(shí),既要削弱它與膜脂的疏水性結(jié)合,又要使它保持疏水基在外的天然狀態(tài),較難分離純化。由于表面活性劑具有兩親性,它一直作為膜蛋白理想的增溶劑。增溶時(shí),膜蛋白疏水部分嵌入膠束的疏水核中而與膜脫離,又保持了膜蛋白表面的疏水結(jié)構(gòu)。相分離后,膜蛋白與表面活性劑共同析出,與親水性蛋白質(zhì)分離。所以,CPE法在分離純化膜蛋白方面極有優(yōu)勢(shì)。已經(jīng)成功地分離出乙酰膽堿脂酶、噬菌調(diào)理素、細(xì)菌視紫紅質(zhì)、細(xì)胞色素c氧化酶等內(nèi)嵌膜蛋白。有一些蛋白在表面活性劑/水兩相間的分配比較反常。如一種管形內(nèi)嵌膜蛋白:乙酰膽堿受體在CPE體系中分配在水相。由于這種受體疏水部分不規(guī)則,很難與TritonX-114的疏水基團(tuán)相互作用;而在體系中加入帶有線形烷基鏈的亞麻油酸,乙酰膽堿受體可被萃取入表面活性劑相。另外,內(nèi)嵌糖蛋白上的糖含量較高,在少量TritonX-114(0.06%)存在下,它們也表現(xiàn)為親水性。(2)tri能力分離CPE在分離植物蛋白如多酚氧化酶(PPO)、酪氨酸酶時(shí),其體系中的酚類化合物(如鞣酸)和葉綠素可與TritonX-114形成褐色沉淀除去。解決了傳統(tǒng)方法硫酸銨分級(jí)法、丙酮粉末法處理時(shí)出現(xiàn)的多酚與酶結(jié)合,葉綠素干擾酶活性等問(wèn)題。CPE法較溫和,不會(huì)改變活性潛伏的酶的結(jié)構(gòu),如在分離活性潛伏的酪氨酸酶時(shí),保留了二酚酶和酪氨酸酶的潛伏活性?，F(xiàn)在已經(jīng)成功地用該法分別從植物的根、葉和果實(shí)中分離出多酚氧化酶。(3)糖液萃取成分的選擇一般的CPE只能根據(jù)蛋白質(zhì)的疏水性不同進(jìn)行分離。在表面活性劑中引入親和配體或使用親和衍生表面活性劑,可以選擇性地將親水性蛋白質(zhì)萃取入表面活性劑相中。Saitoh等第一個(gè)報(bào)道了在兩性型表面活性劑C9APSO4中引入疏水性的親和試劑分別萃取親水性的抗生物素蛋白及己糖激酶。而加入親和試劑TritonX-114卻不能有效地萃取出這兩種親水性蛋白質(zhì)。還有使用TritonX-114-汽巴藍(lán)絡(luò)合物純化哺乳脫氫酶。另一篇報(bào)道中,使用C10E4-丙氨酰丙氨酸衍生膽固醇親和標(biāo)記物絡(luò)合濁點(diǎn)萃取了萬(wàn)古霉素。若體系中引入帶電的表面活性劑或聚合物,還可以根據(jù)蛋白質(zhì)的帶電不同加以分離。Sivars等在C12E5/葡聚糖中分別引入陰離子表面活性劑、陽(yáng)離子表面活性劑及葡聚糖硫酸鹽,研究了凈電荷不同的親水性蛋白質(zhì)(BSA、乳球蛋白、肌紅蛋白、細(xì)胞色素c和溶菌酶)在這4種體系中的分配。結(jié)果發(fā)現(xiàn),這5種親水性蛋白質(zhì)由于與帶電的聚合物的排斥作用或帶電的表面活性劑的吸引作用,被萃取入表面活性劑相。蛋白質(zhì)的凈電荷、體系pH值、帶電表面活性劑濃度顯著影響親水性蛋白質(zhì)在兩相中的分配。另有報(bào)道,用TritonX-114/陰離子葡聚糖硫酸鹽(Dx-S)從豬肝的微粒體中分離純化細(xì)胞色素b5。加入Dx-S后,微粒體的萃取率顯著下降,而細(xì)胞色素b5的萃取率上升。濃縮因子和萃取率與DEAE-纖維素柱分離效果相當(dāng)。CPE法可以作為色譜分離細(xì)胞色素b5前的預(yù)純化步驟。在該領(lǐng)域的另一發(fā)展是使用烷基葡糖苷表面活性劑代替聚氧乙烯表面活性劑與水溶性聚合物(如葡聚糖、PEG)結(jié)合,在0℃左右引發(fā)相分離,使疏水物質(zhì)和親水物質(zhì)分離。Triton系列的表面活性劑由于其較強(qiáng)的疏水性與較低的純度易使蛋白質(zhì)失活,而用辛基葡糖苷/聚合物則不易使蛋白失活。如用辛基β-D硫葡糖苷與PEG或葡聚糖幾乎可以定量萃取細(xì)胞色素P450和b5。用烷基葡糖苷/水溶性聚合物體系還有其它優(yōu)點(diǎn):通過(guò)控制聚合物的類型和濃度可在任何溫度引發(fā)相分離,還可在聚合物上結(jié)合一定官能團(tuán)控制某疏水蛋白的萃取效率。這種CPE適用于不穩(wěn)定蛋白,可在0—4℃下進(jìn)行低溫操作,同時(shí)烷基葡糖苷的臨界膠束濃度較大,可以通過(guò)濾膜分離蛋白和烷基葡糖苷。2.cpe在生物分析中的應(yīng)用(1)蛋白修飾及酶催化作用生物分子在表面活性劑/水兩相體系中的分配主要是依據(jù)其表面所具有的親水性疏水性基團(tuán)。所以,CPE法也可以用來(lái)表征蛋白質(zhì)。首先,可以通過(guò)目標(biāo)蛋白在表面活性劑中的萃取效率來(lái)判斷蛋白質(zhì)是否為內(nèi)嵌膜蛋白。第二,改變pH、引入配體和酶后,可通過(guò)觀察蛋白質(zhì)在兩相間分配的變化了解其構(gòu)象變化,來(lái)研究翻譯表達(dá)后蛋白修飾及特定體系中蛋白-蛋白間作用力大小。蛋白激酶C-α與精氨酸多肽底物結(jié)合后在表面活性劑相中的萃取率明顯提高。這說(shuō)明與底物結(jié)合后,酶的疏水部分暴露得更多了。CPE法也可以考察pH引發(fā)的溶酶體糖蛋白——皂角苷(Sap)的構(gòu)象變化。在中性條件下,A、B、C和D4種類型的Sap都分配進(jìn)水相;當(dāng)pH值降低,SapA、C和D都被萃取進(jìn)表面活性劑相,說(shuō)明它們的疏水性部分暴露出來(lái),只有SapB保留在水相。用這種方法也可以研究腺病毒蛋白、脊髓灰質(zhì)炎病毒、羧肽酶E、流感病毒紅血球凝集素、內(nèi)涵蛋白、網(wǎng)格蛋白及一些毒素在pH改變后構(gòu)象的變化。(2)將萃取物與表面活性劑分離CPE可以作為高效液相色譜(HPLC)、流動(dòng)注射分析(FIA)、毛細(xì)管電泳(CE)等儀器分析的樣品前處理方法,提高檢出靈敏度。表面活性劑可以防止樣品吸附在玻璃容器上,易于與FIA中的載液及HPLC中的有機(jī)流動(dòng)相或膠束流動(dòng)相混合,可以直接進(jìn)樣。但是在很多應(yīng)用中需要除去表面活性劑后再與儀器聯(lián)用。將萃取物與表面活性劑分離的方法很多。對(duì)于CMC>1mM的表面活性劑如兩性離子表面活性劑可用透析法,但操作時(shí)間較長(zhǎng)(24h左右)。對(duì)于CMC較小的表面活性劑可通過(guò)色譜柱分離除去,如凝膠柱、毛細(xì)管柱等,分離出的表面活性劑可以再利用,也可以用廢丙酮焚燒處理。但CPE作為HPLC的樣品前處理方法有兩個(gè)缺點(diǎn):第一,常用的表面活性劑在UV區(qū)域有很強(qiáng)的背景吸收。為克服這一弊端,可以改變檢測(cè)方式,如采用電化學(xué)檢測(cè)器或熒光檢測(cè)器;還可選用在UV檢測(cè)區(qū)無(wú)吸收的表面活性劑如兩性離子表面活性劑或CnEm型表面活性劑。第二,操作時(shí)間較長(zhǎng),從色譜柱上需用幾個(gè)小時(shí)洗脫表面活性劑。表面活性劑的洗脫可