運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠腎上腺一氧化氮合酶及細(xì)胞凋亡的影響

運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠腎上腺一氧化氮合酶及細(xì)胞凋亡的影響

腎上腺是人體的重要生理器，可以分泌各種腎上腺激素，這在人體的許多生理功能中起著重要作用。如果腎上腺皮膚和骨髓因增生和腫瘤而產(chǎn)生過多的激素，或者其他原因引起的腎上腺損傷，則會(huì)出現(xiàn)腎上腺功能障礙或萎縮等相關(guān)疾病。最近的研究表明，一些腎上腺疾病與晚發(fā)高血壓密切相關(guān)。例如，嗜鉻細(xì)胞瘤、谷合歡綜合征和乙醛基丙烯酸酯增多也會(huì)導(dǎo)致晚發(fā)高血壓。運(yùn)動(dòng)激勵(lì)機(jī)幾乎與所有器官和組織有關(guān)，腎臟也在其中。目前,多數(shù)研究是通過對(duì)腎上腺分泌激素水平來反映運(yùn)動(dòng)應(yīng)激時(shí)腎上腺的功能狀況,關(guān)于不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠腎上腺組織細(xì)胞凋亡與NOS表達(dá)的影響研究報(bào)道尚缺.本文旨在探討不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠腎上腺產(chǎn)生的影響及其可能機(jī)制.1試驗(yàn)對(duì)象和方法1.1大鼠尾運(yùn)動(dòng)方案雄性SD大鼠24只(3月齡,由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物管理中心提供),體重246.8±3.4g,國家標(biāo)準(zhǔn)嚙類動(dòng)物飼料喂養(yǎng),自由飲食,室溫17℃～23℃,濕度40%～60%.大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、有氧運(yùn)動(dòng)組和大強(qiáng)度疲勞組.有氧運(yùn)動(dòng)組和大強(qiáng)度疲勞組采用遞增強(qiáng)度方式進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng),運(yùn)動(dòng)負(fù)荷參照Bedford的研究進(jìn)行.對(duì)照組正?；\內(nèi)喂養(yǎng),不運(yùn)動(dòng).有氧運(yùn)動(dòng)組,共8周.起始速度為15m/min,時(shí)間為20min.遞增速度為3m/min,時(shí)間為5min,運(yùn)動(dòng)至速度為20m/min后增加跑臺(tái)坡度5%,時(shí)間為60min.疲勞運(yùn)動(dòng)組.遞增速度3m/min,時(shí)間為5min,運(yùn)動(dòng)至速度為35m/min后增加跑臺(tái)坡度10%,時(shí)間為60min.1.2樣品的取樣和準(zhǔn)備20%烏拉坦腹腔麻醉,迅速開腹摘取腎上腺,10%中性甲醛固定,石蠟包埋、切片(厚5μm),常規(guī)脫蠟至水.1.3免疫總免疫組化采用SABC法,按試劑盒(博士德)說明書操作步驟進(jìn)行.切片用去離子水沖洗,3%H2O2封閉,經(jīng)微波抗原修復(fù)15min,磷酸鹽緩沖液(Phosphatebuffersolution,PBS)沖洗,加生物素封閉液10min,滴加正常非免疫血清,滴加一抗(nNOS、iNOS、eNOS、Bax、Bcl-2均為1∶100,兔抗小鼠、大鼠、人多克隆抗體,博士德)4℃過夜,復(fù)溫,PBS沖洗,滴加二抗,PBS沖洗,滴加SABC,Tween、PBS液洗2h,DAB顯色,脫水,透明,封片.每次染色設(shè)陰性對(duì)照,用PBS取代一抗.1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用OLMPUS顯微圖像分析系統(tǒng)測(cè)定平均光密度值(Meanopticaldensity,MOD),結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,所有數(shù)據(jù)采用SPSS軟件分析,組間比較采用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.2結(jié)果2.1兩組nas和inos的比較免疫組織化學(xué)染色顯示,NOS以棕黃色或棕色顆粒廣泛分布在腎上腺皮質(zhì)球狀帶、束狀帶和網(wǎng)狀帶.與對(duì)照組比較,有氧訓(xùn)練組nNOS、eNOS的MOD值顯著增加,而iNOS值無顯著變化;疲勞訓(xùn)練組NOS三個(gè)亞型的MOD值均顯著性增加.與有氧運(yùn)動(dòng)組比較,疲勞運(yùn)動(dòng)組NOS三個(gè)亞型的MOD值均顯著性增加(表1).3.2既有訓(xùn)練組中bax的變化情況免疫組織化學(xué)染色顯示,Bax和Bcl-2均以棕黃色或棕色顆粒主要分布在腎上腺皮質(zhì)球狀帶、束狀帶和部分髓質(zhì)細(xì)胞的胞漿中.與對(duì)照組比較,有氧訓(xùn)練組中Bax的MOD值顯著性下降,Bcl-2值顯著性上升,Bcl-2/Bax比值更接近于1;疲勞訓(xùn)練組中Bax值顯著上升,Bcl-2值顯著下降,Bcl-2/Bax的比值更小于1.與有氧訓(xùn)練組比較,疲勞訓(xùn)練組中Bax值顯著上升,Bcl-2值顯著下降.表明不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠腎上腺組織細(xì)胞凋亡蛋白Bax和Bcl-2表達(dá)的影響不同(表2).3分析與討論3.1no影響腎理酶制度的調(diào)節(jié)作用體內(nèi)一氧化氮(nitrieoxide,NO)是由NOS催化L-精氨酸(L-arg)而生成.NOS有3個(gè)亞型,分別為eNOS、nNOS和iNOS.NOS是NO合成的限速酶,二者存在必然的依存關(guān)系.還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸黃遞酶(NADPH-d)是NOS的輔酶,組織化學(xué)中常被用來顯示NOS.實(shí)驗(yàn)證實(shí),腎上腺皮質(zhì)球狀帶、網(wǎng)狀帶、束狀帶細(xì)胞和髓質(zhì)部分嗜鉻細(xì)胞均呈NADPH-d陽性,表明腎上腺實(shí)質(zhì)細(xì)胞可廣泛產(chǎn)生NO.文獻(xiàn)報(bào)道,正常大鼠腎上腺皮質(zhì)束狀帶主要表達(dá)eNOS和nNOS,運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR)并沒有顯示出iNOS蛋白的表達(dá),分析原因可能是iNOS表達(dá)需一定刺激因素使其誘導(dǎo)產(chǎn)生.Natarajan等用免疫組織化學(xué)方法顯示,正常大鼠腎上腺皮質(zhì)球狀帶也有eNOS的表達(dá).Cymeryng等證實(shí),NO的供體SNAP(S-nitroso-N-acetylpenicy-llamine)和SNP(sodiumnitroprusside)對(duì)豬血小板能量代謝能顯著降低大鼠在基礎(chǔ)狀態(tài)和應(yīng)激狀態(tài)(刺激ACTH增加)下腎上腺皮質(zhì)束狀帶中皮質(zhì)酮的產(chǎn)生量,經(jīng)注入NOS抑制劑N-硝基-L精氨酸甲酯(L-NAME)后其皮質(zhì)酮的分泌量顯著增加,從而證實(shí)NO在調(diào)節(jié)腎上腺內(nèi)分泌功能方面起著重要作用.Cymeryng隨后又證實(shí),腎上腺皮質(zhì)束狀帶細(xì)胞生成的類固醇亦可被L-arg所抑制,說明NO參與了腎上腺類固醇分泌的調(diào)節(jié)作用,其意義在于適量的NO產(chǎn)生,抑制了腎上腺皮質(zhì)束狀帶類固醇的合成而有利于防止過度的應(yīng)激反應(yīng).Hanke等研究表明,適量的eNOS抑制了培養(yǎng)的腎上腺球狀帶細(xì)胞醛固酮的合成,且這種作用與培養(yǎng)細(xì)胞的氧濃度關(guān)系密切.Husain等實(shí)驗(yàn)證實(shí),大鼠腎上腺血管緊張素濃度是血漿濃度的100多倍,腎上腺皮質(zhì)球狀帶細(xì)胞膜上分布有血管緊張素Ⅱ-1型受體(AT1),該受體激活導(dǎo)致醛固酮分泌,腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞膜上分布有血管緊張素Ⅱ-2型受體(AT2),該受體激活導(dǎo)致腎上腺素和去甲腎上腺素等兒茶酚胺物質(zhì)的分泌,一氧化氮能夠下調(diào)腎上腺血管緊張素受體,抑制醛固酮和兒茶酚胺物質(zhì)的過多分泌,若用NOS抑制劑L-NAME抑制了NO的生成,則血管緊張素受體表達(dá)增加.綜合上述觀點(diǎn),表明NO不同程度地調(diào)節(jié)著腎上腺的內(nèi)分泌功能.運(yùn)動(dòng)對(duì)腎上腺NOS的影響尚無文獻(xiàn)報(bào)道,但關(guān)于運(yùn)動(dòng)對(duì)腎上腺分泌物的影響已有諸多報(bào)道.經(jīng)典理論認(rèn)為,應(yīng)激反應(yīng)主要是交感-腎上腺髓質(zhì)和下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)(hypothalamopituitaryadrenal,HPA)軸相繼活化,其糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid,GC)水平升高而啟動(dòng)一系列神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng).適量GC分泌有利于機(jī)體動(dòng)員能量和保持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定,但若機(jī)體長期處于應(yīng)激狀態(tài),機(jī)體始終處于高濃度GC中,即使是生理性的應(yīng)激反應(yīng),對(duì)機(jī)體也將十分不利.已有實(shí)驗(yàn)表明,長期中小強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)會(huì)對(duì)GC和ACTH等指標(biāo)產(chǎn)生良好的適應(yīng)性變化,適度的運(yùn)動(dòng)可使GC的分泌減少,白細(xì)胞膜上GC受體數(shù)目減少,并可提高IL-1水平.本文實(shí)驗(yàn)顯示,有氧運(yùn)動(dòng)大鼠腎上腺eNOS和nNOS的表達(dá)顯著性升高,iNOS無顯著性變化,提示,有氧訓(xùn)練使腎上腺NOS合成適度增加,即NO的適度升高可能抑制或降低了GC隨運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的持續(xù)升高,防治運(yùn)動(dòng)性疲勞的過早出現(xiàn);同時(shí)運(yùn)動(dòng)所介導(dǎo)的適量NO生成可能下調(diào)了腎上腺血管緊張素受體,其意義在于防止過強(qiáng)生理性應(yīng)激反應(yīng)時(shí),血壓的偏高和對(duì)身體各個(gè)靶器官造成的損害.因此認(rèn)為,腎上腺組織NOS的適量增加可能是有氧運(yùn)動(dòng)防治高血壓等心血管疾病的機(jī)制之一.NO適量合成會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生有益的影響,但大量NO合成會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用而損傷機(jī)體組織.研究顯示,在關(guān)木通引起的腎上腺皮質(zhì)增生和腎損害過程中,腎上腺損害早于腎臟損害,其毒性效應(yīng)機(jī)制可能與DNA氧化損傷和NO增多有關(guān).本文研究顯示,與對(duì)照組和有氧運(yùn)動(dòng)組比較,疲勞運(yùn)動(dòng)激活了大鼠腎上腺組織內(nèi)NOS的三個(gè)亞型表達(dá),NOS活性的升高與NO的生成量成正比,疲勞運(yùn)動(dòng)可使NOS的活性過度升高,導(dǎo)致腎上腺組織內(nèi)NO過度增加.過量NO可產(chǎn)生過多的NO-,NO-作為一種自由基和氣體信使分子,可以自由通過細(xì)胞膜,從而攻擊細(xì)胞膜,參與腎上腺細(xì)胞的損傷.由此提示,過量的NOS在腎上腺組織內(nèi)的表達(dá)也是導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)性疲勞的重要原因之一.3.2amh對(duì)肝腎組織中bax、bak和bcl-2表達(dá)的影響正常成年大鼠腎上腺組織內(nèi)側(cè)的網(wǎng)狀帶存在一定數(shù)量的凋亡細(xì)胞,Bax和Bcl-2主要在腎上腺皮質(zhì)區(qū)上的束狀帶和網(wǎng)狀帶表達(dá).Fogt等證實(shí),正常人腎上腺皮質(zhì)球狀帶、網(wǎng)狀帶、束狀帶細(xì)胞和部分髓質(zhì)嗜咯細(xì)胞均可見Bcl-2蛋白的表達(dá);在皮質(zhì)腫瘤細(xì)胞和嗜咯細(xì)胞瘤中Bcl-2的表達(dá)顯著下調(diào).因此認(rèn)為,Bcl-2的水平可作為衡量腎上腺是否發(fā)生腫瘤的一個(gè)顯著標(biāo)志.眾所周知,Bcl-2家族中除Bax和Bcl-2外,尚有其他許多凋亡的相關(guān)基因,如p53和c-myc等,它們之間相互作用,通過形成同源或異源二聚體,或直接調(diào)控細(xì)胞凋亡.Bak和Bax一樣是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因之一,正常人腎上腺Bak在皮質(zhì)中表達(dá),而在髓質(zhì)不表達(dá).目前認(rèn)為,在Bcl-2家族中,尤其是Bax、Bak和Bcl-2的異常表達(dá)與諸多疾病的發(fā)生關(guān)系密切.朱述琳等對(duì)腎上腺髓質(zhì)增生(AMH)大鼠和正常對(duì)照組大鼠的腎上腺組織細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2和Bax表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn),AMH組大鼠組織Bcl-2的表達(dá)較正常對(duì)照組明顯增強(qiáng)(P<0.05);而Bax的表達(dá)較正常對(duì)照組明顯降低(P<0.05),提示Bcl-2表達(dá)增強(qiáng)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的減少在AMH的發(fā)生過程中起重要作用,Bax的表達(dá)明顯降低,提示其促進(jìn)細(xì)胞凋亡的功能也降低,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡減少,引起腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞增生.另有文獻(xiàn)報(bào)道,大鼠皮質(zhì)束狀帶和網(wǎng)狀帶均有Bax和Bcl-2的表達(dá),網(wǎng)狀帶的染色較深,二者的表達(dá)高于皮質(zhì)束狀帶;摘除大鼠卵巢后腎上腺皮質(zhì)束狀帶和網(wǎng)狀帶Bcl-2和Bax表達(dá)都增加;球狀帶中Bax表達(dá)增加,而Bcl-2表達(dá)陰性,補(bǔ)充17β-雌二醇后,束狀帶和網(wǎng)狀帶中Bcl-2蛋白表達(dá)均顯著降低,Bax在束狀帶中表達(dá)極顯著降低,而在網(wǎng)狀帶中沒有陽性產(chǎn)物;在球狀帶中Bcl-2表達(dá)上升,而Bax表達(dá)下降.表明雌激素在腎上腺皮質(zhì)各層發(fā)揮著復(fù)雜的作用.本文實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),經(jīng)8周有氧訓(xùn)練的大鼠腎上腺與對(duì)照組比較,Bax表達(dá)顯著性下降,而Bcl-2表達(dá)顯著性上升,Bcl-2/Bax的比值更接近于1.Bcl-2蛋白家族成員是在細(xì)胞凋亡過程中起重要作用的一類蛋白質(zhì),Bax和Bcl-2基因分別是Bcl-2蛋白家族成員中表達(dá)產(chǎn)生的促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白,Bcl-2與Bax兩者表達(dá)的比率直接決定了細(xì)胞凋亡的易感性,腎上腺結(jié)構(gòu)與功能正常情況下兩者的表達(dá)是適中的.在適量運(yùn)動(dòng)的情況下,腎上腺組織細(xì)胞凋亡受到抑制,正常細(xì)胞的生存占優(yōu)勢(shì)地位;經(jīng)過8周疲勞訓(xùn)練的大鼠腎上腺組織與對(duì)照組和有氧訓(xùn)練組比較,Bax的表達(dá)均顯著性升高,而Bcl-2的表達(dá)均顯著性下降,Bcl-2/Bax比值減小,提示機(jī)體在進(jìn)行大強(qiáng)度疲勞性運(yùn)動(dòng)后,腎上腺組織可能出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)疲勞性損傷,腎上腺皮質(zhì)和髓質(zhì)凋亡動(dòng)態(tài)失衡.3.3對(duì)大鼠肝腎nos表達(dá)的影響NO在許多生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用,這種泛肽信號(hào)分子調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的凋亡,細(xì)胞是否進(jìn)入凋亡取決于促凋亡因子和抗凋亡因子之間的平衡與否.大量研究顯示,NO具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抗細(xì)胞凋亡的雙重特性,其促進(jìn)凋亡和抗凋亡的作用很大程度上依賴于量的多少和所作用的細(xì)胞類型.高濃度的NO會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞凋亡,低濃度時(shí)則會(huì)延緩細(xì)胞凋亡.有學(xué)者提出,來源于具有組織活性的內(nèi)皮型和神經(jīng)型的NO,通常對(duì)組織細(xì)胞產(chǎn)生一種生理性保護(hù)作用,而來源于iNOS的高劑量NO,則促進(jìn)細(xì)胞的死亡,參與機(jī)體的病理生理過程.本文結(jié)果表明,在長期適度有氧訓(xùn)練后大鼠腎上腺NOS適度表達(dá)的同時(shí),細(xì)胞凋亡受到抑制,使正常細(xì)胞的生存占優(yōu)勢(shì)地位;長時(shí)間疲勞訓(xùn)練激活了大鼠腎上腺iNOS高表達(dá)的同時(shí),使得其他二個(gè)亞型的NOS